綠色熒光蛋白在植物病理學(xué)研究中的應(yīng)用

蔣 明， 呂枷薪， 黃余磊， 苗立祥， 倪雪莉， 鮑笑笑

（1.臺(tái)州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，臨海 317000； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，杭州 310021）

綠色熒光蛋白在植物病理學(xué)研究中的應(yīng)用

蔣 明1＊， 呂枷薪1， 黃余磊1， 苗立祥2， 倪雪莉1， 鮑笑笑1

（1.臺(tái)州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，臨海 317000； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，杭州 310021）

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是生命科學(xué)研究中的一種重要報(bào)告基因，本文在論述GFP的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)和發(fā)光原理的基礎(chǔ)上，從抗病基因的亞細(xì)胞定位、啟動(dòng)子活性分析、病原菌－植物互作研究和基因表達(dá)分析等方面討論GFP在植物病理學(xué)研究中的應(yīng)用。

綠色熒光蛋白； 植物病理學(xué)； 報(bào)告基因； 應(yīng)用

報(bào)告基因（reporter gene）是編碼某種檢測(cè)蛋白或酶的基因，通過(guò)它的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控情況，具有靈敏度高、可信度好和檢測(cè)方便等優(yōu)點(diǎn)［1］。報(bào)告基因種類繁多，如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（chloramphenicol acetyl transferase，CAT）基因、分泌型堿性磷酸酶（secreted alkaline phosphatase，SEAP）基因、綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基 因、β－葡 萄 糖 苷 酶 （β－glucosidase，GUS）基因、β－半乳糖苷酶（β－galactosidase，β-Gal）基因和螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase，F(xiàn)L）基因等。由于GFP具有熒光性質(zhì)穩(wěn)定、觀察方便、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害、無(wú)物種特異性、不受假陽(yáng)性干擾和無(wú)需底物等優(yōu)點(diǎn)，深受科研和檢測(cè)人員的青睞，目前已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的重要標(biāo)記蛋白。

綠色熒光蛋白于1962年首次在維多利亞多管發(fā)光水母（Aequorea victoria）中發(fā)現(xiàn)，該蛋白在紫外光照射下發(fā)出明亮的綠光［2］；1992年P(guān)rasher成功克隆GFP的全長(zhǎng)cDNA，2年后首次將GFP基因作為報(bào)告基因?qū)氪竽c桿菌（Escherichia coli）和秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在無(wú)任何輔助底物的情況下，GFP可以在活細(xì)胞中發(fā)光［3］；通過(guò)基因突變和化學(xué)修飾對(duì)GFP基因進(jìn)行改造，解決了GFP熒光強(qiáng)度低、光選擇性差和光譜狹窄等缺陷，目前熒光顏色已涵蓋紫色到紅色的所有可見光區(qū)域［4］。近年來(lái)，GFP基因在啟動(dòng)子分析、轉(zhuǎn)基因監(jiān)測(cè)、藥物檢定、污染物示蹤、抗病檢測(cè)和基因表達(dá)調(diào)控等方面得到了廣泛應(yīng)用［5－8］。GFP基因在植物病理學(xué)研究中也得到了廣泛應(yīng)用，本文將展開相關(guān)論述。

1 GFP的發(fā)現(xiàn)

生物發(fā)光是一種普遍現(xiàn)象，自然界中，大約有700種生物能夠發(fā)光，包括細(xì)菌、大型真菌和動(dòng)物，約80%的發(fā)光生物生活在海洋中，它們通過(guò)發(fā)光來(lái)尋找食物、逃避敵害和吸引異性［9］。生物發(fā)光通常需要底物的參與，如螢火蟲發(fā)光是通過(guò)熒光酶（lu-ciferase）催化熒光素（luciferin）來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而GFP是一種能在藍(lán)色光線激發(fā)下發(fā)出綠色熒光的特殊蛋白質(zhì)，在發(fā)現(xiàn)初期并未受到重視，它只是研究水母素（aequorin）時(shí)的副產(chǎn)品［10］。20世紀(jì)90年代，GFP在大腸桿菌中成功表達(dá)，開創(chuàng)了該蛋白的應(yīng)用先河，之后在生命科學(xué)多個(gè)領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用，并取得了令人矚目的成就［3，11］。

2 GFP的結(jié)構(gòu)與發(fā)光原理

野生型GFP基因組全長(zhǎng)為2 600bp，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，編碼區(qū)全長(zhǎng)為717bp，分別以ATG和TAA為起始和終止密碼子，編碼238個(gè)氨基酸，分子量為27ku。GFP的三維結(jié)構(gòu)呈圓筒形，11個(gè)β折疊圍在四周，1個(gè)α螺旋貫穿整個(gè)圓筒結(jié)構(gòu)，其中3個(gè)氨基酸殘基Ser65-Tyr66-Gly67構(gòu)成發(fā)色團(tuán)，位于圓筒中央并附著在α螺旋上［12］。盡管在氨基酸水平上僅23%的相似性，但GFP的結(jié)構(gòu)與從Discosomasp.分離到的紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）十分相似，后者也是由11個(gè)β折疊和1個(gè)α螺旋組成，形狀也呈折疊筒狀［12］。GFP的發(fā)光原理是：Gly67的?；蚐er65的羧基經(jīng)親核反應(yīng)生成咪唑基，Tyr66通過(guò)脫氫使芳香團(tuán)與咪唑基結(jié)合，形成對(duì)羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色團(tuán)發(fā)出熒光［13］。

天然GFP的熒光強(qiáng)度低，表達(dá)易受溫度影響，通過(guò)改變發(fā)色團(tuán)氨基酸種類和排列順序，獲得了改良型的GFP。將第65位的Ser突變成Thr，可顯著增加熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性；第66位氨基酸Tyr突變?yōu)镠is或Trp，熒光波長(zhǎng)變短，可分別得到發(fā)藍(lán)光和藍(lán)綠光的GFP；改變發(fā)色團(tuán)周邊氨基酸的種類，也可以使熒光波長(zhǎng)發(fā)生變化，將第203位的Thr突變成Tyr，就可獲得黃色熒光［14，4］。

3 GFP在植物病理學(xué)研究中的應(yīng)用

隨著成像技術(shù)、檢測(cè)手段的快速發(fā)展，GFP基因及其突變體作為報(bào)告基因在分子生物學(xué)領(lǐng)域中得到了大規(guī)模應(yīng)用。GFP基因在植物病理學(xué)方面主要體現(xiàn)在抗病基因的亞細(xì)胞定位、啟動(dòng)子活性分析、病原菌－植物互作研究和基因表達(dá)分析等方面。

3.1 抗病基因的亞細(xì)胞定位

真核細(xì)胞具有復(fù)雜亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位是細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。亞細(xì)胞定位能明確表達(dá)蛋白或產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的出現(xiàn)部位，常用的方法有免疫熒光技術(shù)、膠體金標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)和GFP融合蛋白技術(shù)等。免疫熒光技術(shù)將免疫學(xué)方法與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布，通過(guò)檢測(cè)熒光素發(fā)出的熒光對(duì)組織或細(xì)胞中的抗原進(jìn)行細(xì)胞定位，這種方法具有簡(jiǎn)便、快速和特異等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是敏感性低、定量困難和易受化學(xué)發(fā)光物質(zhì)干擾［16］。膠體金標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物或顯色劑，利用其在堿性條件下帶負(fù)電的特點(diǎn)進(jìn)行抗體標(biāo)記，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和定位正確等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)步驟多、技術(shù)難度大。而GFP具有熒光性質(zhì)穩(wěn)定、無(wú)物種特異性、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒、靈敏度高和能在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，GFP融合蛋白技術(shù)已成為亞細(xì)胞定位的重要手段。

NPR1基因是擬南芥（Arabidopsis thaliana）系統(tǒng)獲得抗性中的一個(gè)關(guān)鍵基因，它在植物抗病反應(yīng)中起到重要作用，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將NPR1-GFP融合基因?qū)霐M南芥，結(jié)果表明，NPR1基因在細(xì)胞核中表達(dá)，在病菌誘導(dǎo)下，NPR1-GFP整合蛋白的積累量增加［17］。OsWRKY13是水稻（Oryza sativa）的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，過(guò)量表達(dá)能提高對(duì)白葉枯病和稻瘟病的抗性，將GFP-OsWRKY13融合基因?qū)胙笫[表皮，結(jié)果表明該基因在細(xì)胞核中表達(dá)，并進(jìn)一步證明OsWRKY13具有DNA結(jié)合活性［18］。過(guò)氧化物酶在抗病反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用，將一粒小麥（Triticum monococcum）過(guò)氧化物酶基因TmPRX8與GFP融合后導(dǎo)入洋蔥表皮，融合蛋白出現(xiàn)在液泡中［19］。

3.2 啟動(dòng)子活性分析

啟動(dòng)子是一段直接與RNA聚合酶及轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，決定基因轉(zhuǎn)錄起始與否的特定DNA序列，采用有效的啟動(dòng)子能夠顯著提高外源基因在植物中的表達(dá)水平，因此啟動(dòng)子活性檢測(cè)是植物基因工程的重要內(nèi)容之一。傳統(tǒng)的啟動(dòng)子活性檢測(cè)采用β－葡萄糖苷酸酶基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因和冠纓堿合成酶基因等作為報(bào)告基因，檢測(cè)時(shí)需要特定的底物和輔助因子，而且對(duì)植物組織或細(xì)胞具有破壞性。GFP是啟動(dòng)子分析的新型報(bào)告基因，利用熒光顯微鏡觀察基因表達(dá)情況，能較正確地鑒定啟動(dòng)子活性大小，并達(dá)到量化的目的［20］。

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）是一種應(yīng)用廣泛的殺蟲微生物，已成功地用于防治農(nóng)業(yè)、林業(yè)、貯藏物害蟲及醫(yī)學(xué)昆蟲，隨著微生物農(nóng)藥需求量的增大和人類環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，生物安全日益受到人們的重視。利用GFP基因研究了蘇云金芽胞桿菌Pcry3A和PBtⅠ＿BtⅡ等啟動(dòng)子的活性，為有效選擇驅(qū)動(dòng)標(biāo)記基因最優(yōu)的表達(dá)體系和進(jìn)一步構(gòu)建高效、安全的基因工程菌創(chuàng)造了條件［21］。利用GFP基因作為報(bào)告基因，采用基因槍法進(jìn)行洋蔥表皮遺傳轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)24h后檢測(cè)基因表達(dá)情況和熒光強(qiáng)度，能正確測(cè)定出啟動(dòng)子活性的大小［20］。

3.3 病原菌與植物互作研究

病原菌侵染植物過(guò)程中，病原菌無(wú)毒基因產(chǎn)物與寄主植物抗病基因產(chǎn)物相互識(shí)別和結(jié)合，產(chǎn)生的信號(hào)分子通過(guò)傳導(dǎo)，激活一系列抗病基因的表達(dá)，引發(fā)復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，從而表現(xiàn)出抗病特性［22］。深入研究植物與病原菌的識(shí)別方式、親和性或非親和性的互作模式，對(duì)揭示植物－病原菌互作機(jī)制的認(rèn)識(shí)具有重要意義［23］。研究病原菌與植物互作的傳統(tǒng)方法有組織印跡法、放射性標(biāo)記核酸探針?lè)ê虶US染色法等，這些均為非活體檢測(cè)，因此有一定的局限性［21］。而GFP能有效克服這一弊端，可直觀、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)病原菌的發(fā)生、定殖和侵染過(guò)程，目前已成為研究病原菌與植物互作的有力工具［25］。

煙草黑脛病是煙草生產(chǎn)過(guò)程中的重要病害，世界各地均有發(fā)生，利用原生質(zhì)體介導(dǎo)法將GFP基因?qū)氩≡≒hytophthora imperfectavar.nicotianae）中，觀察到了煙草黑脛病菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)和與寄主互作方式，這是GFP首次作為報(bào)告基因在病原微生物研究中的應(yīng)用［26］。香蕉葉斑病和斑枯病由球腔菌屬（Mycosphaerella）真菌引起，其中香蕉黑條葉斑病菌（M.fijiensis）和香蕉黃條葉斑病菌（M.musicola）為葉斑病的病原菌，而M.eumusae為斑枯病的病原菌，將GFP基因?qū)脒@3種真菌，清楚地觀察到了病菌在葉片組織中的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，并且發(fā)現(xiàn)隨著菌絲的侵入葉片逐漸褪綠和壞死［27］。草莓炭疽病是草莓（Fragaria ananassa）生產(chǎn)的重要病害，近年來(lái)發(fā)生十分嚴(yán)重，尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）是草莓炭疽病的病原菌，它侵染葉片、匍匐莖、花蕾、萼片和果實(shí)，用電穿孔法將GFP基因?qū)朊劝l(fā)的分生孢子研究草莓致病炭疽病原菌和非致病炭疽病病原菌的生活規(guī)律，為闡明致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)［28－29］。

利用含GFP基因和氯霉素抗性的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化對(duì)黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）有明顯抑制作用的生防菌株Brevibacillus brevisZJY 1和Bacillus subtilisZJY-116，得到具有GFP綠色熒光和氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，成功檢測(cè)了菌株在田間定殖的可行性，為菌株的實(shí)際開發(fā)利用提供了依據(jù)［30］。以萵苣盤梗霉（Bremia lactucae）Hsp70的啟動(dòng)子和Ham34基因的終止子構(gòu)建GFP表達(dá)載體，利用原生質(zhì)體介導(dǎo)法導(dǎo)入重組載體，觀察到GFP在不同時(shí)期大豆疫霉（Phytophthora sojae）中的表達(dá)情況，同時(shí)明確了大豆疫霉在大豆葉片、下胚軸和根部的侵染行為［31］。

3.4 抗病基因表達(dá)分析

新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（npt）、鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（npt II）、草銨膦（glufosinate）抗性基因（bar）、草甘膦（glyphosate）抗性基因（epsps）等為傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植株選擇標(biāo)記［32］，通常需要6～8周或更長(zhǎng)的時(shí)間才能鑒定出潛在的轉(zhuǎn)基因苗，并經(jīng)Southern雜交分析來(lái)確定是否為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，整個(gè)過(guò)程花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)［33］。使用抗生素、除草劑基因作為轉(zhuǎn)基因標(biāo)記是否會(huì)引發(fā)生物安全問(wèn)題是人們普遍關(guān)注的問(wèn)題，而GFP基因是一種安全、可靠、省時(shí)的標(biāo)記基因，不會(huì)產(chǎn)生“超級(jí)雜草”和“基因逃逸”等生態(tài)問(wèn)題，可替代抗生素、除草劑快速篩選轉(zhuǎn)基因植株或組織，還可通過(guò)標(biāo)記花粉來(lái)研究轉(zhuǎn)基因植物花粉漂移和授粉過(guò)程［5］。

SGT1（suppressor of the G2allele of SKP1）是植物抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的重要調(diào)控基因，參與多種植物抗病基因介導(dǎo)的抗病信號(hào)途徑，SGT1基因的突變或沉默會(huì)導(dǎo)致多種植物R基因介導(dǎo)的抗病性的喪失，SGT1還參與調(diào)控植物的非宿主抗性［34－35］。以GFP為報(bào)告基因?qū)tSGT1a和AtSGT1b的功能進(jìn)行了研究，通過(guò)熒光檢測(cè)，明確了這兩個(gè)抗病基因的表達(dá)部位和表達(dá)量［36］。利用PEG法將來(lái)自水稻的抗病基因Xa21導(dǎo)入柑橘原生質(zhì)體，通過(guò)GFP熒光檢測(cè)獲得愈傷組織和抗性芽，經(jīng)微嫁接后獲得了抗病植株［37］。稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）是水稻白葉枯病的病原，以GFP為報(bào)告基因，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將來(lái)自水稻的抗病基因Xa27導(dǎo)入，結(jié)果表明Xa27對(duì)水稻黃單胞菌具有抗性作用［38］。

4 展望

在對(duì)GFP進(jìn)行突變改造后，現(xiàn)已獲得發(fā)藍(lán)光的BFP、發(fā)黃光的YFP和發(fā)青色光的CFP，研究人員可根據(jù)需要進(jìn)行選擇［4］。值得一提的是，1999年從珊瑚蟲（Discosoma genu）中分離到了與GFP同源的蛋白質(zhì)DsRed，它在紫外線照射下發(fā)出紅色熒光，盡管DsRed與GFP在氨基酸水平上僅23%的相似度，但三級(jí)結(jié)構(gòu)十分相似［12］。與GFP相比，DsRed的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng)，發(fā)射峰位于培養(yǎng)基、組織培養(yǎng)器材及細(xì)胞成分等產(chǎn)生的熒光背景范圍之外，具有較高的信噪比，而且在細(xì)胞內(nèi)熒光轉(zhuǎn)換效率高，檢測(cè)更為容易［39］。隨著研究的進(jìn)一步深入，一定能開發(fā)出更明亮、更穩(wěn)定、穿透性更強(qiáng)的熒光蛋白，它們將成為生命科學(xué)研究的重要工具［40］。

實(shí)驗(yàn)室從青花菜（Brassica oleraceavar.italica）中克隆到了多個(gè)霜霉?。℉yaloperonospora parasitica）抗性相關(guān)基因（downy mildew resistance-related gene，DMR），并以GFP為報(bào)告基因，對(duì)其中的BoDMR1進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化研究。在構(gòu)建重組載體pBI121-GFP-BoDMR1和將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404的基礎(chǔ)上，經(jīng)共培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、熒光檢測(cè)和煉苗，成功獲得了17棵轉(zhuǎn)基因青花菜陽(yáng)性植株，這些植株在紫外線照射下發(fā)出明亮的綠色熒光，抗病性檢測(cè)結(jié)果證實(shí)這些植株對(duì)霜霉菌的抗性均有所增加，個(gè)別達(dá)到高抗水平（待發(fā)表）。GFP的引入，為快速、有效篩選青花菜轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性后代及選育抗病材料提供了保障。

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Applications of green fluorescent protein in plant pathology

Jiang Ming1， LüJiaxin1， Huang Yulei1， Miao Lixiang2， Ni Xueli1， Bao Xiaoxiao1
（1.College of Life Sciences，Taizhou University，Linhai317000，China；2.Institute of Horticulture，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou310021，China）

Green fluorescent protein（GFP）is an important reporter gene in life science research.Based on the discovery，structure and luminescent mechanism of GFP，applications of GFP in plant pathology，including subcellular localization of disease resistant genes，activity analysis of promoters，pathogen-plant interaction and gene expression analysis，were reviewed.

green fluorescent protein； plant pathology； reporter gene； application

Q 78

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.05.006

2010-09-27

2010-12-26

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y3080081）；臺(tái)州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（08XH02）

＊ 通信作者 E-mail：jiangming1973＠139.com