簡青霉對酚類和苯胺類污染物的降解研究*

胡天覺,吳娟娟,曾光明,劉 暉,張 瀅,黃丹蓮,余 冰,沈瑩

(1.湖南大學環(huán)境科學與工程學院,湖南長沙 410082;

2.湖南大學環(huán)境生物與控制教育部重點實驗室,湖南長沙 410082)

簡青霉對酚類和苯胺類污染物的降解研究*

胡天覺?,吳娟娟,曾光明,劉 暉,張 瀅,黃丹蓮,余 冰,沈瑩

(1.湖南大學環(huán)境科學與工程學院,湖南長沙 410082;

2.湖南大學環(huán)境生物與控制教育部重點實驗室,湖南長沙 410082)

在培養(yǎng)4 d的簡青霉培養(yǎng)體系中,分別加入不同濃度的酚類和苯胺類物質(zhì),觀察這些有毒物質(zhì)對簡青霉生長的影響,并研究簡青霉對這幾種有毒物質(zhì)的降解效果.結(jié)果表明:低濃度的酚類和苯胺類物質(zhì)能促進簡青霉的生長,高濃度的這些物質(zhì)則對簡青霉的生長有一定的抑制作用.同時簡青霉能夠很好地催化氧化苯酚,2,4-二氯苯酚和苯胺.當苯酚質(zhì)量濃度為500μg/ m L,2,4-二氯苯酚質(zhì)量濃度為50μg/m L,苯胺的質(zhì)量濃度為1 000μg/m L時,簡青霉對這三者的降解率都接近100%.在2,4-二氯苯酚質(zhì)量濃度為60～125μg/m L,苯胺質(zhì)量濃度為2 000～5 000 μg/m L時,簡青霉對它們的降解率分別達到60%和70%以上.簡青霉對對硝基苯酚和對硝基苯胺降解效果不明顯,在研究的濃度范圍內(nèi),簡青霉對它們的降解率只在10%左右.

苯胺類化合物;簡青霉;酚類化合物;生物降解

酚類化合物主要來源于煤氣廠、石油化工廠和制藥廠等,是重要的化工原料和中間體[1].苯胺類物質(zhì)是制藥、殺蟲劑、除草劑和染料等工業(yè)制備中重要的化工原料[2].由于它們對生物有機體的毒性作用,以及大多數(shù)難以生物降解,已被美國EPA列為優(yōu)先控制的污染物,在我國也被列為“水中優(yōu)先控制污染物”[2-3].

目前酚類和苯胺類化合物的降解方法主要有物理法、化學法和生物法.與物理法和化學法相比,生物法具有成本低,效率高,反應條件溫和以及無2次污染等優(yōu)點.目前,在對微生物降解酚類和苯胺類化合物的研究中,大多數(shù)為細菌降解,如:惡臭假單胞菌、產(chǎn)堿桿菌、不動桿菌和紅球菌降解等[4-5].而細菌的生長容易受有機物濃度,廢水的pH值等因素的影響,尤其對重金屬很敏感.與細菌相比,真菌對有毒污染物具有較強的忍耐性和解毒作用.在酚類和苯胺類的污染中常伴隨著其它各種有害物質(zhì)的污染,因此利用真菌處理含酚廢水和含苯胺類廢水具有很大的應用潛力.

本文研究簡青霉真菌對酚類和苯胺類污染物的降解,為難降解有機物的生物降解提供研究基礎.

1 材料與方法

1.1 儀器設備

無菌操作室,高壓蒸汽滅菌鍋,恒溫振蕩培養(yǎng)箱,濁度儀,離心機,UV-2550紫外分光光度計.

1.2 菌種和培養(yǎng)基

簡青霉由湖南大學環(huán)境科學與工程學院863課題研究組提供.

固體培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):葡萄糖20 g,瓊脂15 g,去皮土豆200 g,蒸餾水1 000 m L.

液體培養(yǎng)基:葡萄糖10 g,NH4 Cl2.0 g,MgSO4?7H2O 0.5 g,KH2PO41.0 g,Na2HPO4?12H2O 0.504 g,MnSO4?H2O 0.039 g,CuSO4?5H2O 0.007 g,FeSO4?7H2O 0.007 g,蒸餾水1 000m L.

1.3 降解體系的建立

250 m L的錐形瓶中裝入100m L的液體培養(yǎng)基(即100/250m L的培養(yǎng)體系),在滅菌后的培養(yǎng)體系中無菌接入107個/m L的孢子懸浮液2 m L,于30℃,140 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng).4 d后在培養(yǎng)體系中分別加入不同濃度酚類和苯胺類物質(zhì),繼續(xù)振蕩培養(yǎng).每組實驗均做3個平行樣.有機物濃度的選擇根據(jù)文獻[6-10]確定.

1.4 降解率的測定

在振蕩培養(yǎng)4 d后的100/250 m L的培養(yǎng)體系中分別加入不同濃度酚類和苯胺類物質(zhì),以未加這些物質(zhì)的培養(yǎng)體系為對照樣,取適量菌液,6 000 r/m in離心15m in,過濾,取上清液,測初始濃度.繼續(xù)培養(yǎng),同樣方法分別測7 d后和10 d后的有機物濃度.最后結(jié)果用對照樣的菌液吸光度加以校正,計算降解率.

酚類化合物采用4-氨基氨替比啉法測定,苯胺類化合物采用萘乙二胺偶氮光度法測定[11].

1.5 漆酶活性測定

以ABTS為底物,反應總體積為3 m L.取2.0 m L 0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH= 5.0),加入0.5 m L 5 mmol/L的ABTS和0.5 m L的粗酶液,混合于30℃水浴中反應3 min,迅速測定OD420值.每個樣品重復做3次,相對標準偏差小于5%.對照組以同等體積的緩沖液代替粗酶液.酶活力單位(U)為:每分鐘催化1 m ol ABTS氧化所需的酶量.

粗酶液的制取:取一定量培養(yǎng)液,6 000 r/min離心15 min,再經(jīng)過孔徑為0.22 m的濾膜過濾.

2 結(jié)果與分析

2.1 酚類和苯胺類物質(zhì)對簡青霉生長的影響

2.1.1 酚類和苯胺類物質(zhì)對簡青霉形態(tài)的影響

在振蕩培養(yǎng)條件下,簡青霉呈球狀生長,培養(yǎng)2 d后,菌球較小,4 d后菌球的直徑為3～4mm,生長較均勻,菌液呈微紅色.繼續(xù)培養(yǎng),10 d后菌球的直徑為5mm,并且菌球表面產(chǎn)生倒刺,如圖1所示.

圖1 對照樣的簡青霉形態(tài)Fig.1 Themorphology of Penicillium sim p licissimum cu ltured w ithout adding toxic substances

加入苯胺和對硝基苯胺后,菌液體系的顏色分別如圖2和圖3所示.在苯胺質(zhì)量濃度為4 000和5 000μg/m L時,菌液呈褐色,且后者比前者的菌液顏色更深,其它濃度的菌液呈土黃色.當加入不同濃度對硝基苯胺時,各濃度體系中均有少量的黃色絮狀沉淀.繼續(xù)培養(yǎng),沉淀溶解,菌液顏色呈黃色,對硝基苯胺的濃度越高,菌液的顏色越深,且菌球也呈黃色,這是因為菌球?qū)ο趸桨酚幸欢ǖ奈阶饔?加入苯酚、對硝基苯酚、2,4-二氯苯酚后菌液的顏色還是呈微紅色,與對照樣相比,未發(fā)現(xiàn)有明顯的變化.

圖2 苯胺質(zhì)量濃度依次為1 000,2 000,3 000, 4 000和5 000μg/m L條件下培養(yǎng)的簡青霉形態(tài)Fig.2 Themorphology of Penicillium simp licissimum cu ltured w ith aniline at the concentration o f 1 000, 2 000,3 000,4 000,5 000μg/m L respectively

圖3 對硝基苯胺質(zhì)量濃度依次為50,100, 150和200μg/m L條件下培養(yǎng)的簡青霉形態(tài)Fig.3 Themorphology of Penicil lium simp licissimum cu ltured with p-nitroanilineat the concentration of 50,100,150,200μg/m L respectively

2.1.2 酚類和苯胺類物質(zhì)對菌球直徑的影響

培養(yǎng)10 d后的降解體系,在不同濃度酚類和苯胺類物質(zhì)作用下簡青霉的菌球直徑如表1所示.

表1 不同濃度酚類和苯胺類物質(zhì)作用下簡青霉菌球直徑Tab.1 The sphere diameter of Penicillium simp licissimum under different concentration of phenols and anilines

低濃度的有機物對簡青霉的生長影響不大,與對照樣中的菌球直徑相比,沒有明顯變化,菌球直徑都在5mm左右.有機物對簡青霉的毒性作用隨著有機物本身濃度的增加而增大,菌球直徑則隨有機物濃度的增加而減小.簡青霉在高濃度有機物作用下,菌球直徑是3～4 mm,當苯胺的質(zhì)量濃度為4 000,5 000μg/m L時,簡青霉的菌球直徑最小,為2～3 mm.

2.1.3 酚類和苯胺類物質(zhì)對簡青霉生物量的影響

培養(yǎng)10 d后的降解體系經(jīng)6 000 r/min的離心機離心15m in后,過濾,菌體烘干至恒重,稱重,測量不同濃度酚類和苯胺類物質(zhì)作用下簡青霉的生物量.

由表2可以看出,與對照樣中的簡青霉生物量相比,在低濃度有機物的作用下,簡青霉的生物量有一定的增加,當有機物的濃度逐漸增大時,簡青霉的生物量則明顯減少.

表2 不同濃度酚類和苯胺類物質(zhì)作用下簡青霉生物量Tab.2 The biomass of Penicillium sim plicissimum under different concentration of phenols and anilines

2.2 液體培養(yǎng)條件下簡青霉的漆酶活性

在培養(yǎng)4 d后的體系中,分別加入苯酚、對硝基苯酚、2,4-二氯苯酚、苯胺和對硝基苯胺,使它們在菌液體系中的質(zhì)量濃度分別為500,50,25,1 000和25μg/m L,每天取樣測酶活性,對照樣則在培養(yǎng)開始時每天取樣測酶活性.液體培養(yǎng)條件下的漆酶活性隨時間的變化如圖4所示.

圖4 液體培養(yǎng)條件下簡青霉漆酶活性Fig.4 Laccase activities o f Penicillium sim p licissimum in liquid cu ltivation

在培養(yǎng)的初始階段,漆酶的活性很低,幾乎接近零.隨著時間的增加,酶活性緩慢上升.在培養(yǎng)4～7 d時,酶活性明顯增加,且變化率要大于培養(yǎng)8～10 d時的上升率.培養(yǎng)4 d后,加入酚類和苯胺類物質(zhì),漆酶的活性隨時間的變化趨勢和對照樣是一致的,只是在數(shù)值上有些微差異.剛加入污染物,漆酶活性相比于對照樣略有上升,在培養(yǎng)的后幾天漆酶活性與對照樣酶活性基本維持在一個水平.

2.3 簡青霉對幾種酚類和苯胺類物質(zhì)的降解

簡青霉對酚類和苯胺類物質(zhì)的降解如圖5所示.

簡青霉對酚類和苯胺類物質(zhì)的降解率隨酚類和苯胺類物質(zhì)質(zhì)量濃度的增加逐漸減小.

簡青霉對苯酚、2,4-二氯苯酚、苯胺的降解效果較好.當苯酚的質(zhì)量濃度在500μg/m L左右時, 10 d后的降解率高達100%.當2,4-二氯苯酚的質(zhì)量濃度為50μg/m L時,降解率達到100%,隨著2,4-二氯苯酚濃度增加至90μg/m L時,10 d后簡青霉對它的降解率減少至60%,且在一定的濃度范圍內(nèi),降解率均保持在60%以上.當苯胺的質(zhì)量濃度為1 000,2 000μg/m L時,簡青霉對它的降解率高達80%以上,質(zhì)量濃度為3 000,40 000和5 000 μg/m L時,簡青霉對它的降解率均在60%左右.

簡青霉對對硝基苯酚和對硝基苯胺很難降解,當對硝基苯酚質(zhì)量濃度為25μg/m L時,降解率只有15%左右,在研究的濃度范圍內(nèi)簡青霉對對硝基苯酚的降解率均低于15%.當對硝基苯胺質(zhì)量濃度為25μg/m L時,降解率達到13%左右.可見簡青霉對對硝基苯酚和對硝基苯胺很難降解.

圖5 7 d和10 d后不同濃度酚類和苯胺類物質(zhì)的降解效果Fig.5 The degradation rate o f phenols and anilines in different concentrations by Penicil lium simp licissimum after 7 and 10 days

2.4 酚類和苯胺類物質(zhì)降解隨時間的變化關系

在培養(yǎng)4 d后的體系中,分別加入苯酚、對硝基苯酚、2,4-二氯苯酚、苯胺和對硝基苯胺,使其在菌液體系中的質(zhì)量濃度分別為500,60,25,1 000, 25μg/m L.每天定時取樣.簡青霉對酚類和苯胺類物質(zhì)的降解隨時間的變化關系如圖6所示.

圖6 酚類和苯胺類物質(zhì)的降解隨時間的變化關系Fig.6 The degradation rate of pheno ls and anilines in the variation of time

簡青霉對苯酚、2,4-二氯苯酚、苯胺有很好的降解作用,在培養(yǎng)5～7 d時,簡青霉對它們的降解作用比較明顯,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,降解率的增幅逐漸減小.而簡青霉對對硝基苯酚和對硝基苯胺較難降解,培養(yǎng)10 d后,降解率均低于20%.而且在降解的前幾天,簡青霉對它們基本上沒有降解.隨著培養(yǎng)時間的增加,降解率緩慢增加.

2.5 分析

在培養(yǎng)的初始階段,營養(yǎng)物質(zhì)比較充足,簡青霉大量生長,當培養(yǎng)4 d以后,簡青霉的菌球直徑達到3～4 mm,菌球數(shù)量較多,營養(yǎng)物質(zhì)也被大量消耗, C,N源短缺,從而促進漆酶的分泌.所以從圖4中可以看到,培養(yǎng)4 d以后漆酶活性較培養(yǎng)初期有大幅提高.培養(yǎng)7 d以后,漆酶仍呈增加的趨勢,只是增幅較前一階段有所下降.這與酚類和苯胺類物質(zhì)隨時間的降解情況是一致的(圖6).這說明,酚類和苯胺類物質(zhì)的降解與簡青霉漆酶活性有一定的關系,降解率隨漆酶活性的增加而增大.

低濃度的酚類和苯胺類物質(zhì)對簡青霉的生長有一定的促進作用,這是因為低濃度的有機物為簡青霉補充了一定的C,N源,促進了簡青霉的生長,所以在低濃度的有機物作用下,簡青霉的生物量比對照樣中多,分泌的漆酶活性相比對照樣中的漆酶活性也要略高一點.當酚類和苯胺類物質(zhì)濃度逐漸增加,它們對簡青霉的毒性逐漸增強,簡青霉的生物量和菌球直徑均低于對照樣中的值(表1,表2).說明高濃度的有毒物質(zhì)對簡青霉的生長有抑制作用.

從簡青霉對不同濃度酚類和苯胺類物質(zhì)的降解情況可以看出,簡青霉對低濃度有機物降解率高于對高濃度有機物的降解率,這可能是因為:首先,低濃度的有機物能成為簡青霉的營養(yǎng)物質(zhì),促進簡青霉的生長,簡青霉的菌體數(shù)量增加,在代謝過程中分泌的漆酶較多;其次,有機物本身對簡青霉有一定的毒害作用,當濃度很高時則會抑制簡青霉的生長,影響簡青霉的代謝.簡青霉能較好地降解苯酚、2,4-二氯苯酚、苯胺,而對對硝基苯酚和對硝基苯胺較難降解,這可能與對硝基苯酚和對硝基苯胺中的硝基有一定的關系.

3 結(jié) 論

1)低濃度酚類和苯胺類物質(zhì)對簡青霉生長有促進作用,高濃度時對簡青霉生長有一定的抑制作用.

2)簡青霉對酚類和苯胺類物質(zhì)的降解隨時間的變化,與漆酶活性隨時間的變化規(guī)律一致.說明酚類和苯胺類物質(zhì)的降解與簡青霉分泌漆酶有關.

3)簡青霉對苯酚、2,4-二氯苯酚、苯胺都有很好的降解能力,而對對硝基苯胺和對硝基苯酚的降解效果較差,這說明帶硝基的苯環(huán)物質(zhì)比不帶硝基的苯環(huán)物質(zhì)更難被簡青霉降解.

[1] SRIHARI V,DAS A.Comparative studies on adsorptive removalof phenolby th ree agro-based carbons:equilibrium and isotherm studies[J].Ecotoxicology and Environm en tal Safety, 2008,71(1):274-283.

[2] XIAO CB,NING J,YAN H,et al.Biodegradation of aniline by a new ly isolated Delf tia sp.XYJ6*[J].Chinese Jou rnal of Chem ical Engineering,2009,17(3):500-505.

[3] CASTILLEJOS-LóPEZ E,NEVSKAIA D M,MU?OZ V,et al.On the interactions of phenol,aniline and p-nitrophenol on activated carbon su rfacesas detected by TPD[J].Carbon, 2008,46(6):870-875.

[4] LI J,JIN Z,YU B,etal.Isolation and characterization of aniline deg radation sligh tly halophilic bacterium,erw inia sp. strain HSA 6[J].M icrobiological Research,2010,165(5):418 -426.

[5] YAO R S,SUN M,WANG C L,et al.Degradation of phenolic compounds w ith hyd rogen peroxide catalyzed by enzyme from ser ratia marcescens AB 90027[J].W ater Research, 2006,40(16):3091-3098.

[6] 聶永平,鄧正棟,袁進.苯胺廢水處理技術研究進展[J].環(huán)境污染治理與設備,2003,4(3):77-81.

NIE Yong-ping,DENG Zheng-dong,YUAN Jin.Application and development of treatment technology for aniline wastewater[J]. Techniques and Equipment for Environmental Pollution Control, 2003,4(3):77-81.(In Chinese)

[7] 彭紅,羅開昆,高中洪,等.產(chǎn)漆酶真菌的篩選、培養(yǎng)及對苯酚的降解[J].華中科技大學學報:自然科學版,2005,33(7):111-114.

PENG Hong,LUO Kai-kun,GAO Zhong-hong,et a l. Screening and cu ltivation of fungi strains producing lassase and its degradation of phenol[J].H uazhong University of Science and Technology:Natu re Science Edition,2005,33(7):111-114.(In Chinese)

[8] 張瑩,李小明,楊麒,等.絲瓜瓤固定黃孢原毛平革菌對2,4-二氯酚的降解研究[J].工業(yè)用水與廢水,2008,39(4):27-31.

ZHANG Ying,LI Xiao-m ing,YANG Qi,et al.Biodegradation of 2,4-DCP by phanerochaetechrysospor ium imm obilized on Iufa cylindrical sponge[J].IndustrialW ater&W astewater, 2008,39(4):27-31.(In Chinese)

[9] 董小軍,洪青,李戀,等.對硝基苯酚降解菌Pseudomonas sp. PDS-7的降解特性及其降解相關基因的克隆[J].微生物學報, 2008,48(11):1486-1492.

DONG X iao-jun,HONG Qing,LI Lian,et al.Characterization of a p-nitrophenol degrading bacterium Pseudomonas sp. PDS-7 and cloning of deg radation relevant genes[J].Acta M icrobiologica Sinica,2008,48(11):1486-1492.(In Chinese)

[10]楊彬,雷樂成.混合培養(yǎng)微生物好氧降解對硝基苯胺的特性研究[J].環(huán)境工程,2003,21(3):73-75.

YANG Bin,LEI Le-cheng.Study on characteristicsof aerobic degradation of p-nitroanilinum by mixed cu lture microbe[J]. Environmen tal Engineering,2003,21(3):73-75.(In Chinese)

[11]國家環(huán)保局.水和廢水監(jiān)測分析方法[M].4版.北京:中國環(huán)境科學出版社,2003:460-468.

M inistry of Environm ental Protection of the People's Republic of China.Monitoring and analysis method of w ater and w astew ater[M].4 th ed.Beijing:China Environm ental Science Press,2003:460-468.(In Chinese)

Research on the Degradation Effect of Contaminants like Phenols and Anilines by Using Penicillium sim p licissimum

HU Tian-jue?,WU Juan-juan,ZENG Guang-ming,LIU H ui,ZHANG Ying, HUANG Dan-lian,YU Bing,SHEN Ying

(1.College of Environmental Science and Engineering,Hunan Univ,Changsha,Hunan 410082,China;2.Key Laboratory of
Environmental Biology and Pollution Control(Hunan Univ),Ministry of Education,Changsha,Hunan410082,China)

In order to study the grow th of Penicillium simp licissimum exposed to phenolsand anilines, and the deg radation of these toxic substances,several different concentrations of phenols and anilinesw ere added to the culture system,which was cultured for 4 daysw ith Penicillium sim p licissimum.The results have show n that low concentrations of pheno ls and anilines can p rom ote the grow th of Penicillium sim p licissimum,But on the contrary,the grow thw ould be restrained under the culture of high concentrations.M eanwhile,Penicillium sim p licissim um can catalyze and oxidize phenol,2,4-dich lorophenol and aniline effectively.When the concentration of phenol was controlled at 500μg/m L,2,4-dichlorophenol was 50μg/m L,and anilinew as1 000μg/m L,the degradation rates of phenol,2,4-dichlorophenoland anilinewere all close to 100%.When the concentration of 2,4-dichlorophenolwas controlled at 60～125μg/ m L and anilinew as 2 000～5 000μg/m L,the degradation rates were over 60%and 70%,respectively. However,the degradation effect of p-nitrophenol and p-nitroaniline by Penicillium sim p licissimum was worse,and their degradation rate was only about 10%.

phenolic compounds;Penicillium simp licissimum;aniline compounds;biological degradation

Q89

A

1674-2974(2011)04-0061-05 *

2010-05-07

湖南省自然科學基金資助項目(07JJ5053)

胡天覺(1966-),男,湖南長沙人,湖南大學副教授,博士

?通訊聯(lián)系人,E-mail:hutj66@yahoo.com.cn.