朱 丹，王 希，朱延明，陳 超，李 勇，柏 錫，才 華，紀 巍

（東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

在基因的功能研究過程中，外源重組基因表達產(chǎn)物的功能與其在宿主細胞中的定位有重要的關(guān)系，特別是對于真核細胞，蛋白質(zhì)位于不同的細胞部位所行使的功能也不同，所以研究其在宿主細胞中的亞細胞定位，對研究外源重組基因表達產(chǎn)物的功能或未知新基因的功能來說具有很重要的意義。目前被廣泛應用的能進行亞細胞定位的報告基因主要是綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）。綠色熒光蛋白是細胞生物學和分子生物學研究中的一個重要的工具，綠色熒光蛋白相對分子質(zhì)量很小，能與多種不同的蛋白質(zhì)N端或C端融合而保持其天然蛋白的特性，因此是一種直觀性很強的遺傳標記物[1-3]。通過與某單一序列的融合，可特異地進行細胞核、線粒體、質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器的定位。由于GFP基因其產(chǎn)物可以自身發(fā)光，不需要任何底物和輔助因子參與就能檢測其活性，所以用GFP進行亞細胞定位，避免了提純蛋白、標記異硫氰酸熒光素等熒光染料、經(jīng)顯微注射或其他方式導入細胞的復雜方法，從而使研究蛋白在活細胞的準確定位變得簡單易行[4-6]。但在研究基因在植物細胞中的定位時，必須構(gòu)建與基因融合的GFP亞細胞定位載體，常常會因酶切位點的難以選擇使得構(gòu)建周期長，操作復雜，如果能構(gòu)建出具有多個可用酶切位點的植物表達載體卡盒，將大大縮短載體構(gòu)建周期，節(jié)省大量人力物力[7-8]。

本研究通過酶切連接手段消除pCAMBIA-1302載體本身的多克隆位點（Multip cloning site，MCS），同時通過高保真PCR擴增克隆了原核表達載體pET-32b的多克隆位點，并將此多克隆位點插入已消除本身多克隆位點的載體pCAMBIA-1302的GFP基因序列前，構(gòu)建成植物GFP亞細胞定位載體卡盒pCEG；通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法，將此載體卡盒pCEG于煙草葉片中進行瞬時表達，用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP蛋白的亞細胞定位情況，發(fā)現(xiàn)GFP蛋白在細胞質(zhì)和細胞核都有表達，證明此載體卡盒可用于植物基因的亞細胞定位分析；本研究所構(gòu)建的載體卡盒為目的基因的植物亞細胞定位載體的構(gòu)建帶來了很大的便利，也為目的基因在宿主細胞中的亞細胞定位研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌菌株DH5α，根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105。

植物GFP亞細胞定位載體pCAMBIA-1302，植物表達載體pEbTIP，原核表達載體pET-32b均由東北農(nóng)業(yè)大學植物生物工程研究室保存；中間表達載體pCEbT和植物GFP亞細胞定位載體卡盒pCEG由本研究室構(gòu)建；測序載體pGEM-T購自Promega公司。質(zhì)粒圖譜見結(jié)果與分析。

1.1.2 常用試劑及酶類

LA TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶及DNA膠回收試劑盒均購自大連寶(TaKaRa)生物工程公司?？敲顾?、氨芐青霉素等其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。引物合成、DNA測序由上海生物工程公司完成。

1.1.3 植物材料

煙草品種為本氏煙。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒DNA提取、電泳、酶切、大腸桿菌及農(nóng)桿菌感受態(tài)制備、轉(zhuǎn)化、菌落PCR

均采用常規(guī)分子生物學操作技術(shù)，具體操作步驟參照文獻[9]。

1.2.2 瓊脂糖凝膠中DNA片段的回收

按照試劑盒操作說明進行。

1.2.3 連接反應方法

具體操作步驟參照文獻[10]。

1.2.4 引物設(shè)計

根據(jù)原核表達載體pET-32b上MCS區(qū)附近的序列，應用Primer Premier 5.0軟件分析其內(nèi)部酶切位點，設(shè)計一對MCS的克隆引物，為方便后續(xù)載體構(gòu)建，上游引物端從NcoⅠ位點開始設(shè)計，并在下游端加入了BglⅡ位點。最終確定引物序列如下:

根據(jù)載體pCEG上新插入的MCS上游區(qū)的堿基序列，應用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計了一條引物用于載體卡盒pCEG中新插入的MCS的測序，其引物序列如下:

1.2.5 農(nóng)桿菌介導的亞細胞定位載體卡盒pCEG對煙草的轉(zhuǎn)化

將質(zhì)粒pCEG轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，通過PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pCEG的農(nóng)桿菌注射培養(yǎng)4周大小的煙草葉片。

1.2.6 GFP亞細胞定位觀察

取侵染后3 d的煙草葉片，在激光共聚焦顯微鏡488 nm檢測波長下，觀察GFP蛋白的表達情況以及亞細胞定位情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物GFP亞細胞定位載體pCAMBIA-1302中MCS的消除

用Eco RⅠ和PstⅠ雙酶切質(zhì)粒pCAMBIA-1302，消除其多酶切位點（MCS），同樣用Eco RⅠ和PstⅠ雙酶切質(zhì)粒pEbTIP并回收切下的大小約280bp不含有常用酶切位點的基因片段作為小接頭，與切成線性的pCAMBIA-1302連接，構(gòu)建成中間表達載體，命名為pCEbT。將pCEbT轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有Km的LB培養(yǎng)基平板上篩選轉(zhuǎn)化菌落，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，并用SalⅠ和BglⅡ進行雙酶切鑒定，酶切電泳圖結(jié)果顯示不能切下約700bp大小的條帶，證明SalⅠ酶切位點已被消除，即證明質(zhì)粒pCAMBIA-1302中的MCS已被消除（見圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒pCEbT的構(gòu)建及酶切鑒定Fig.1 Construction and characterization with endonucleases of recombination plasmid pCEbT

2.2 原核表達載體pET-32b MCS的獲得

分析原核表達載體pET-32b上MCS區(qū)附近的序列及其內(nèi)部酶切位點，設(shè)計一對MCS的克隆引物，并在上游引物端加入NcoⅠ酶切位點，在下游端加入BglⅡ酶切位點。

以原核表達載體pET-32b為模板，采用設(shè)計的引物進行高保真PCR擴增，擴增出約100bp的特異帶，即pET-32b的MCS，其堿基序列及所含的酶切位點如圖2所示。將得到的DNA片段與pGEM-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有Amp的LB培養(yǎng)基平板上篩選轉(zhuǎn)化菌落，將鑒定正確的陽性克隆菌落送交測序，測序結(jié)果正確。

2.3 植物GFP亞細胞定位載體卡盒pCEG的構(gòu)建

分析pGEM-T（含pET-32b的MCS）和pCEbT的酶切位點，設(shè)計了pCEG構(gòu)建方案，即用BglⅡ和SphⅠ雙酶切pGEM-T（含pET-32b的MCS）并回收大小約3.1 kb的線性大片段，用BglⅡ單酶切pCEbT，將兩載體的酶切產(chǎn)物進行線性連接，并回收線性連接產(chǎn)物，然后用NcoⅠ單酶切回收的線性連接產(chǎn)物，并回收酶切產(chǎn)物大片段，最后用T4DNA連接酶進行NcoⅠ酶切產(chǎn)物的自身環(huán)化連接，構(gòu)建成最終載體卡盒pCEG（見圖3）。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有Km的LB培養(yǎng)基平板上篩選轉(zhuǎn)化菌落，提取陽性克隆質(zhì)粒，并用SalⅠ和PstⅠ進行雙酶切鑒定，凝膠電泳結(jié)果顯示能切下大小約900bp的條帶，證明終載體卡盒pCEG中存在SalⅠ酶切位點，即新合成的MCS成功插到了質(zhì)粒pCEbT的GFP基因序列前面。為了進一步驗證終載體卡盒pCEG中新插入的MCS的正確性，在載體卡盒pCEG中新插入的MCS上游區(qū)設(shè)計了一條引物（引物序列見材料與方法）用于新插入的MCS的測序，將酶切鑒定正確的終載體卡盒pCEG和新合成的引物送交測序，測序結(jié)果與pET-32b的MCS序列完全一致，其堿基序列所具有的酶切位點及順序如圖2所示，即證明終載體卡盒pCEG構(gòu)建正確。

圖2 pET-32b 的MCS堿基序列及酶切位點Fig.2 Base sequence and restriction enzyme cutting site of MCS in pET-32b

2.4 亞細胞定位載體卡盒pCEG對煙草的轉(zhuǎn)化及GFP蛋白的亞細胞定位分析

為了驗證植物亞細胞定位載體卡盒pCEG的可應用性，將載體卡盒pCEG轉(zhuǎn)到根瘤農(nóng)桿菌EHA105中，通過篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子；將轉(zhuǎn)化了pCEG的根瘤農(nóng)桿菌EHA105對煙草葉片進行注射，使煙草葉片瞬時表達pCEG中的GFP蛋白，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，GFP蛋白在煙草葉片的細胞核及細胞質(zhì)中均有強烈表達（見圖4），說明此載體卡盒可用于目的基因的亞細胞定位分析。

圖4 載體卡盒pCEG中GFP蛋白在煙草葉片中的亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization of GFP protein of plasmid pCEG in N.benthamiana

3 討論與結(jié)論

3.1 植物GFP亞細胞定位載體卡盒pCEG的通用性

由于亞細胞定位載體卡盒pCEG的GFP基因序列前面插入了一個多克隆位點，而載體本身的多克隆位點已被消除，為目的基因構(gòu)建與GFP融合的蛋白提供了很多可用的酶切位點，為目的基因的亞細胞定位載體構(gòu)建過程提供了很多便利，這將大大縮短載體構(gòu)建周期，節(jié)省大量人力物力。

由于亞細胞定位載體卡盒pCEG具有與pET-32b相同的多克隆位點（MCS），且位于報告基因GFP之前，任何研究的目的基因可直接從pET-32b上切下來連到卡盒pCEG上，而不會改變基因表達的編碼框，大大簡化了目的基因和GFP基因構(gòu)成融合基因來用于目的基因的亞細胞定位分析的操作過程。

3.2 大載體與小片段連接策略

本研究需要將大小約0.1 kb的DNA小片段（pET-32b的MCS）連接到大小為10.7 kb的大載體上。由于小片段和大載體大小相差懸殊，若直接對兩載體用NcoⅠ和BglⅡ進行雙酶切連接，要得到連接產(chǎn)物pCEG會比較困難。本試驗通過分析兩載體上的酶切位點，設(shè)計了一個巧妙的連接過程（見圖3）。其先將大小為3.1 kb的載體和大小為10.7 kb的載體進行線性連接，連接成的大片段用NcoⅠ單酶切，回收后的片段進行自連即可獲得最終載體卡盒pCEG，使得小片段和大載體連接困難的問題得到很好的解決。

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