宋佰芬,劉 哲,曹宏偉,馬金柱,徐 闖,崔玉東,朱戰(zhàn)波,黃玉蘭

(黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院,黑龍江大慶163319)

干擾素(interferon,IFN)是在特定的誘生劑作用下,由細胞分泌的具有一定的抗病毒、抗腫瘤和調節(jié)免疫功能等活性的糖蛋白[1]。根據(jù)IFN蛋白的氨基酸結構、抗原性和細胞來源以及它們所結合受體的不同,可將IFN分為兩類,即Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN。Ⅰ型IFN常分為2個亞型,分別由白細胞和成纖維細胞產生,可抑制病毒DNA和蛋白質合成,活化NK細胞,促進MHCI類分子遞呈抗原。Ⅱ型干擾素又稱為γ干擾素,主要由CD4+Th1型、CD8+T細胞以及NK細胞產生,它除了具有抗病毒、抗腫瘤活性外,更重要的是它還具有促進MHCⅡ類抗原表達、增強APC與T細胞的相互作用、增強T細胞輔助抗體產生和細胞毒性T細胞產生的能力等諸多免疫調節(jié)活性[2]。

養(yǎng)牛業(yè)在我國國民經濟中占據(jù)著相當重要的地位,但是牛的一些烈性傳染病,尤其是病毒病嚴重威脅著養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。研究表明,BoIFN-γ是一種高活性、多功能的生物活性糖蛋白,具有強烈的免疫調節(jié)作用,對寄生在細胞內的各種病原體均具有有效的抑制作用[3]。無論作為疫苗佐劑或其他類型的生物制劑,BoIFN-γ均可明顯提高機體抗感染能力,并且具有安全、高效、無毒副作用等特點[4]。但在通常情況下,機體內IFN-γ表達量甚微,不能直接提取純化[5]。因此,應用IFN-γ作為疫苗佐劑或抗病毒性藥物,必須通過基因工程技術在體外生產重組IFN-γ。隨著基因工程、蛋白質工程和發(fā)酵與細胞工程的深入發(fā)展,大規(guī)模、高效率地生產具有生物學活性的干擾素已成為可能,這將使人們把干擾素廣泛地應用于科學研究和臨床,并為最終戰(zhàn)勝疾病提供充足的理論和實踐基礎[6]。

因此,為了解決這一問題我們實驗室構建了原核表達重組菌,對其進行表達和純化,并免疫小鼠制備了多克隆抗體,為進一步研究該蛋白的生物學功能奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 青年健康黑白花奶牛;8周齡Balb/c小鼠。

1.1.2 宿主菌、載體 大腸埃希菌BL21、x-LI Blue由黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院細胞生物學實驗室保存,載體pMD18-T、pQE-30為哈爾濱無限峰生物技術有限公司產品。

1.1.3 工具酶和試劑 T rizol抽提試劑盒為Invitrogen產品;DNA膠回收純化試劑盒、質粒抽提試劑盒、EcoRⅠ、TaqDNA聚合酶、DL 2 000、DL 15 000、蛋白質分子量標準為寶生物工程(大連)有限公司產品;弗氏佐劑、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG、刀豆蛋白(ConA)等為Sigma公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 參照GenBank中已發(fā)表的BoIFN-γ核苷酸序列,應用DNA Star軟件設計了一對特異性引物,引物上游加入BamHⅠ酶切位點和3個保護性堿基,下游引物加入了EcoRⅠ酶切位點和3個保護性堿基,引物序列為:上游:BamHⅠ:GAGGGATCCATGAAATATACAAGCTAT;下游:EcoRⅠ:GACGAAT TCT TACGTTGATGCTCTCC。預計擴增片段長度為510 bp左右,包括BoIFN-γ信號肽的整個ORF,引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.2 牛脾臟淋巴細胞的分離與誘導培養(yǎng) 無菌采集牛脾臟,快速將脾臟剪切、研磨,分離出單個細胞。離心后用每管5 mL Hank′s懸浮細胞,用膠頭滴管緩緩加入到5 mL淋巴細胞分離液中,具體方法參照淋巴細胞分離液說明書進行。最后用含ConA濃度為7.5 μ g/mL的1640全培養(yǎng)液重新懸浮細胞,調整細胞濃度到107個/mL,加入到24孔細胞培養(yǎng)板,置37℃、體積分數(shù)為5%的二氧化碳的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)18 h。

1.2.3 牛脾臟淋巴細胞總RNA的提取 經Con A誘導培養(yǎng)18 h后,離心收集淋巴細胞,之后,按T rizol Reagent說明書上的操作方法進行。

1.2.4 BoIFN-γ基因cDNA的合成 以提取的牛脾臟淋巴細胞總RNA為模板,參照寶生物工程(大連)有限公司的反轉錄酶使用說明書合成cDNA。

1.2.5 BoIFN-γ基因的克隆及純化 PCR反應體系為50 μ L。在PCR反應管中分別加入cDNA模板10 μ L,5×PCR緩沖液10 μ L,特異上游引物0.5 μ L,EXTaq酶0.25 μ L,加滅菌超純水至50 μ L,置PCR儀中進行PCR擴增。首先94℃預變性2 min;然后94℃30 s,54.6℃30 s,72℃30 s,共30個循環(huán);最后72℃延伸10 min,4℃結束反應,用瓊脂糖凝膠電泳檢測產物。

根據(jù)DNA回收試劑盒說明書對RT-PCR產物進行純化。將DNA置—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 重組質粒的構建及鑒定 將純化后的目的片段與pMD18-T載體16℃連接30 min,然后轉化大腸埃希菌BL21感受態(tài)細胞,具體步驟參照分子克隆實驗指南[7]。小量制備重組質粒DNA,按照堿裂解法進行[7]。取少量重組質粒DNA進行PCR鑒定,并用EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切鑒定。

1.2.7 序列測定 將鑒定為陽性的重組質粒送上海生物工程技術服務有限公司進行序列測定。用分析軟件DNA Star將測定結果與已知序列進行比較分析,陽性質粒命名為pMD-BoIFN-γ。

1.2.8 重組表達載體的構建 用BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切重組質粒pMD18-IFN-γ,將目的基因切下,亞克隆到相同內切酶處理過的表達載體pQE-30上,轉化x-LI Blue感受態(tài)細胞,涂布于LB固體培養(yǎng)基(含30 μ g/mL Kan),37℃培養(yǎng)過夜。常規(guī)方法提取重組質粒,之后進行酶切鑒定和PCR鑒定,陽性重組質粒命名為pQE30-IFN-γ。

1.2.9 重組蛋白表達 實驗中陽性菌于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達0.6～0.8時,用1.0 mmol/L IPTG于37℃進行誘導表達,而后取樣進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.10 Western blot 經SDS-PAGE電泳后,將凝膠上的蛋白轉印至PVDF膜上,50 g/L脫脂奶粉4℃封閉過夜,抗His-Tag單克隆抗體室溫孵育1 h,PBST洗滌。1∶2 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗IgG室溫孵育1 h,PBST洗滌,DAB顯色,進行Western blot分析。

1.2.11 蛋白的回收、純化 參照文獻[8]進行。

1.2.12 鼠免疫血清的制備 用純化的γ干擾素蛋白與弗氏佐劑混和,免疫8周齡Balb/c小鼠。具體免疫程序參照文獻[9]進行。將血液于37℃靜置1 h,再于4℃冰箱放置3 h～4 h。待血液凝固后,吸取血清,3 000 r/min離心14 min,取上清,分裝后置20℃保存。

1.2.13 ELISA檢測血清抗體效價 將純化的20 μ g/mL的γ干擾素蛋白包被ELISA板,每孔0.1 mL,4℃過夜,每孔再加封閉液0.1 mL,37℃靜置2 h,洗板5次,每孔加入倍比稀釋免疫血清(1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000)0.1 mL,37℃反應45 min,洗板5次,每孔再加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗,37℃反應45 min,洗板,每孔加0.1 mL底物,室溫放置20 min。2 mol/L硫酸50 μ L終止反應,于96孔酶標儀上測定450 nm吸光值。

2 結果

2.1 PCR結果

PCR擴增包含信號肽序列的BoIFN-γ基因片段,取5 μ L PCR產物12 g/L瓊脂糖凝膠電泳,電壓5 V/cm電泳,在紫外透射儀下可見到與預期條帶大小相符的BoIFN-γ為510 bp(圖1)。

圖1 RT-PCR產物電泳分析Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products

2.2 表達載體質粒鑒定結果

為了驗證重組質粒是否為陽性,挑取藍白篩選后的白色菌落進行PCR擴增(圖1)和BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定(圖2)。結果擴增出與預期的片段大小一致,而且為單一條帶,可以初步證明重組質粒為陽性。雙酶切鑒定,得到的片段與預期的片段大小一致,這表明鑒定的重組質粒為陽性。

圖2 重組質粒的酶切鑒定Fig.2 Enzyme digestion of recombinant plasmid

2.3 重組蛋白的SDS-PAGE電泳

重組質粒轉化到x-LI Blue大腸埃希菌后,經1 mmol/L IPTG誘導3 h,當OD600值為0.6～0.8之間時,收集菌液,離心,棄上清洗滌2次～3次,加入上樣緩沖液,煮沸后上樣,每孔上樣10 μ L,然后開始100 g/L SDS-PAGE電泳。結果與對照樣品相比,重組x-LI Blue大腸埃希菌表達出大小為22 ku的蛋白條帶(圖3)。

圖3 表達產物SDS-PAGE電泳結果Fig.3 SDS-PAGE results of expressed products

2.4 Western blot檢測結果

將SDS-PAGE電泳凝膠轉移到硝酸纖維素膜上,經Anti-His-Tag一抗、HRP標記的羊抗鼠IgG的二抗反應,最后經DAB顯色,結果在22 ku處檢測到表達的蛋白質條帶(圖4)。

圖4 表達產物Western blot檢測結果Fig.4 Analysis of expressed products by Western blot

2.5 鼠血清抗體效價的測定結果

血清按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000比例稀釋,陰性對照為未注射該蛋白的小鼠血清。ELISA結果表明,小鼠的抗體效價均在1∶32 000以上,免疫效果較好(表1)。

表1 IFN-γ免疫血清的測定結果T able 1 Detection results of immunized IFN-γserum antibody in mice

3 討論

IFN-γ是一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)作用的細胞因子,主要由活化的T細胞和NK細胞產生。IFN-γ對機體免疫系統(tǒng)具有強大的調節(jié)作用,是機體發(fā)揮免疫功能、清除體內病原體不可缺少的成分[10-11]。因此,IFN-γ在疾病的診斷、治療和疫苗免疫效果檢測等方面具有重大作用,是現(xiàn)代分子生物學、免疫學和臨床醫(yī)學研究的熱點之一。

INF-γ是在特定的誘生劑作用下,由機體自身產生的一種維持機體自我穩(wěn)定的防御性物質。常見的誘生劑包括兩種:一種是促細胞分裂劑,如植物血凝素(PHA)、刀豆素(ConA)、商陸(Poke-weed)、細菌脂多糖(LPS)、葡萄球菌腸毒素(SEA);另一種是特異性抗原,如結核菌素、破傷風毒素、腫瘤細胞等。本研究中用Con A體外誘導牛外周血淋巴細胞后再抽提細胞總RNA,用RT-PCR技術擴增了BoIFN-γ基因。刀豆素蛋白A(ConA)是一種能使高比例的淋巴細胞活化的多克隆激活劑[7]。刺激淋巴細胞活化后,IFN-γ可在0.5 h～20 h開始表達[12]。但本試驗在用Con A刺激4 h左右的時候開始提取細胞總RNA并進行RT-PCR擴增,未獲得成功,這可能和我們培養(yǎng)外周血淋巴細胞活性及刺激濃度有關,也可能是IFN-γ表達量不夠所造成的。后來我們用Con A刺激18 h時提取細胞總RNA并進行RTPCR擴增而獲得成功的。將擴增出的BoIFN-γ基因的cDNA片段連接到pMD18-T載體上測序,測序結果表明,與GenBank中已發(fā)表的序列同源性為99.8%。然后將其連接到原核表達載體pQE-30中,通過將克隆的牛γ干擾素基因定向插入原核表達載體pQE-30的相應位點,轉化x-LI Blue表達菌株,進行誘導,結果成功獲得了表達。取樣重組菌體,煮沸裂解后,將上清和菌體裂解產物分別上樣電泳,證明牛γ干擾素蛋白為可溶性表達。并且蛋白的表達量較大。為后續(xù)的純化帶來了方便,為免疫接種提供了良好的條件。將該蛋白免疫小鼠后獲得的多克隆抗體,經ELISA檢測結果表明,該抗體效價在1∶32 000以上,說明該蛋白具有很好的免疫原性,為進一步研究該蛋白的功能奠定了基礎。

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