牟韶嬌,盛劍秋,謝 惠,金 鵬,陸曉娟,高 巍

1.北京軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科,北京 100700;2.山西醫(yī)科大學

流行病學研究表明,雌激素替代治療能明顯降低大腸癌發(fā)病率[1-3]。但雌激素對大腸癌預(yù)防作用的具體機制仍不明確。DNA錯配修復(fù)(mismatch repair, MMR)系統(tǒng)在維持基因組穩(wěn)定性中起關(guān)鍵作用,其主要功能為修復(fù)DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)的錯配和插入-缺失環(huán)(insertion-deletion loops,IDLs)。我們在前期工作中發(fā)現(xiàn),雌激素對結(jié)腸細胞 MMR系統(tǒng)的影響可能是其預(yù)防大腸癌的機制之一,并觀察到雌激素能上調(diào)結(jié)腸細胞 MMR基因表達[4]。本研究將構(gòu)建細胞MMR活性檢測平臺,進一步探索雌激素對結(jié)腸細胞MMR活性的影響。

1 材料與方法

1.1 pEGFP-N 1質(zhì)粒的改造

1.1.1 使用dam-感受態(tài)ER2925(美國NEB公司)去甲基化處理pEGFP-N1質(zhì)粒(由國家人類基因組北方研究中心諾賽基因公司惠贈,序列詳見:https://www. lablife.org/ct?a=viewvecseq＆vectorid=350)。用限制性內(nèi)切酶StuⅠ和SexAⅠ(美國NEB公司)雙酶切pEGFPN1,去除包括SV40復(fù)制起點上下游的DNA片段(230 bp),瓊脂糖凝膠電泳回收并純化酶切后所得的大片段(約4.5 kb,柱離心型DNA凝膠回收與純化試劑盒,北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司,Lot#101BC,按試劑盒說明書進行),Klenow酶(美國NEB公司)補平大片段,T4連接酶(西班牙Fermentas公司)環(huán)化。轉(zhuǎn)入dam+感受態(tài)DH5α(由國家人類基因組北方研究中心諾賽基因公司惠贈),純化(柱離心型高純質(zhì)粒小量提取試劑盒,北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司,Lot#102AE,按試劑盒說明書進行)后測序和酶切驗證。

1.1.2 利用PCR定點誘變(PCR-based site-directed mutagenesis)技術(shù),在質(zhì)粒上EGFP基因的起始密碼子ATG的上下游插入限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ和NruⅠ的酶切位點。引物序列:5′-ggtggcgaccgggatatcccgggccc-3′,5′-atggtgagcaatcgcgaggagctgttc-3′(下劃線部分分別為EcoRⅤ和NruⅠ的酶切位點,引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成)。PCR反應(yīng)條件(50μL體系):引物各20 pmol、質(zhì)粒模板59 ng、dNTPs 50 nmol、Pfu酶2.5 U、1×Pfu buffer。94℃30 s,72℃13 min,共20個循環(huán)。純化PCR產(chǎn)物(DNA純化與回收試劑盒,北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司,Lot#101BD,按試劑盒說明書進行),T4連接酶環(huán)化。DpnⅠ酶(美國NEB公司)去除原始模板。轉(zhuǎn)入感受態(tài)ER2925,純化(柱離心型高純質(zhì)粒小量提取試劑盒),酶切和測序檢驗所得質(zhì)粒。將新質(zhì)粒命名為p95-1。

1.2 異源/同源雙鏈質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1 用限制性內(nèi)切酶ApaⅠ和NruⅠ(美國NEB公司)雙酶切P95-1質(zhì)粒,瓊脂糖凝膠電泳回收并純化酶切后所得的大片段(約4.5 kb,柱離心型DNA凝膠回收與純化試劑盒)。

1.2.2 構(gòu)建與ApaⅠ/NruⅠ切下的小片段DNA序列相同,但在原EGFP基因起始密碼子ATG處含T-G錯配且無EcoRⅤ酶切位點的異源雙鏈和不含錯配且無EcoRⅤ酶切位點的同源雙鏈。寡核苷酸單鏈序列: EGFP-11:5′-cgggatccaccggtcgccaccatggtgagcaatcg-3′,EGFP-12:5′-cgattgctcaccgtggtggcgaccggtggatcccgggcc-3′,EGFP-13:5′-cgattgctcaccatggtggcgaccggtggatcccgggcc-3′(下劃線部分為原EGFP基因起始密碼子位點,寡核苷酸單鏈由北京奧科生物技術(shù)公司合成)。其中EGFP-11與EGFP-12形成T-G錯配(異源雙鏈),為觀察組;EGFP-11與EGFP-13不形成錯配(同源雙鏈),為對照組。退火反應(yīng)條件(20μL體系):寡核苷酸單鏈各 20 pmol、1×T4 ligase Buffer、T4PNK(美國NEB公司)4 u。置于 37℃水浴鍋中放置30min,再將此體系自100℃緩慢降至 4℃,即可得到所需雙鏈。

1.2.3 用T4連接酶將異源/同源雙鏈與ApaⅠ/NruⅠ酶切所得大片段連接,構(gòu)建異源/同源雙鏈質(zhì)粒。連接反應(yīng)條件:異源/同源雙鏈2μL、P95-1經(jīng)酶切后所得大片段30μL(EB溶解)、10×T4 ligase Buffer 5μL、T4 ligase 400 u加水補齊至50μL,16℃過夜。以EcoRⅤ酶(美國NEB公司)和PSAD酶(質(zhì)粒穩(wěn)定DNA酶,北京中北林格科技發(fā)展有限公司)去除原有的野生型質(zhì)粒,純化(DNA純化與回收試劑盒,北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司)。酶切鑒定所得質(zhì)粒。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染及雌激素對細胞錯配修復(fù)活性的影響去酚紅培養(yǎng)基L-15(美國Hyclone公司)血清剝離培養(yǎng)(0.1%的活性炭濾過的胎牛血清+胸腺嘧啶2mmol/ L)結(jié)腸癌細胞株SW480(由國家人類基因組北方研究中心諾賽基因公司惠贈)24 h后,分別用等量的上述異源或同源雙鏈質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染條件:96孔板培養(yǎng)細胞,100萬細胞/每孔;每孔加入 200 ng質(zhì)粒及 0.64 μL高效真核轉(zhuǎn)染試劑(北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司)。共轉(zhuǎn)染:將紅色熒光質(zhì)粒pDsRed-N1與異源或同源雙鏈質(zhì)粒按1∶1比例共轉(zhuǎn)染SW480細胞,轉(zhuǎn)入DsRed的目的是為了評估轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染完成后孵育 24 h,更換血清剝離培養(yǎng)基,加入不同濃度的雌二醇(estrodiol, E2,美國sigma公司,0、10-10、10-8mol/L),孵育24 h,然后在流式細胞儀下觀察綠色熒光細胞的數(shù)量和熒光強度。以EGFP相對表達值代表細胞MMR活性。EGFP表達值=(LR%gated+UR%gated)/(UL%gated+ UR%gated)。EGFP相對表達值=異源雙鏈EGFP表達值/同源雙鏈EGFP表達值。

2 結(jié)果

SW 480細胞為錯配修復(fù)系統(tǒng)正常的結(jié)腸癌細胞株,轉(zhuǎn)入異源雙鏈質(zhì)粒后,EGFP基因起始密碼子上構(gòu)建的錯配可有部分被修復(fù),修復(fù)成功后即表達正常的EGFP,可誘發(fā)綠色熒光。用異源或同源雙鏈質(zhì)粒與DsRed質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SW 480細胞,轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下大體觀察轉(zhuǎn)染效果,可見異源/同源雙鏈質(zhì)粒(綠色熒光)與DsRed質(zhì)粒(紅色熒光)均轉(zhuǎn)染成功,異源雙鏈熒光細胞數(shù)少于同源雙鏈。加入不同濃度的 E2后,流式細胞儀檢測綠色熒光強度和細胞數(shù),得到異源/同源雙鏈質(zhì)粒EGFP表達值和EGFP相對表達值如表1所示?？梢奅2能增加SW480細胞的EGFP相對表達值,且呈劑量依賴關(guān)系,提示 E2能上調(diào)SW480細胞的MMR活性。

表1 流式細胞儀測定SW 480細胞株EGFP相對表達值Tab 1 The relative exp ression of EGFP in SW 480 cellsw ith Flow cy tometry

3 討論

近年大量臨床研究已證實,女性絕經(jīng)后雌激素替代治療能明顯降低 CRC發(fā)病率[5,6]。這些證據(jù)表明雌激素對 CRC可能有預(yù)防作用[7],但是迄今這一作用具體機制仍不明確。DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)在維持基因組穩(wěn)定性中起關(guān)鍵作用。大部分的遺傳性結(jié)直腸癌由MMR基因種系突變引起,即遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)。另外有10%～15%的散發(fā)性結(jié)直腸癌是由錯配修復(fù)基因hMLH1表遺傳學失活所致。MMR功能障礙導(dǎo)致的結(jié)直腸癌表現(xiàn)為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI)。既往研究表明,在HNPCC家族中,男性突變攜帶者患結(jié)直腸癌的風險高于女性突變攜帶者[8];對中國人HNPCC家系的研究也發(fā)現(xiàn)了類似情況[9]:HNPCC家系中女性成員發(fā)病率低于男性成員,甚至在某些HNPCC家系中,達到平均發(fā)病年齡的男性均發(fā)生大腸癌,但攜帶突變基因的女性成員迄今為止無1例發(fā)病。這種HNPCC發(fā)病率上的性別差異可能與雌激素有關(guān)[10]。而Slattery等[11]的研究發(fā)現(xiàn),年輕女性MSI陽性結(jié)腸癌的發(fā)生率低于年老女性,而絕經(jīng)后雌激素替代治療能降低MSI陽性結(jié)腸癌風險,因此認為雌激素可以預(yù)防MMR功能缺陷引起的結(jié)直腸癌。在本研究中,我們建立了一種能檢測體外活細胞MMR功能的體系,并觀察了雌激素對結(jié)腸細胞MMR功能的影響。

該方法在質(zhì)粒pEGFP-N1的增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因起始密碼子上引入錯配,用含錯配EGFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞,只有修復(fù)該錯配才能產(chǎn)生有功能的EGFP,因此可以用綠色熒光強度代表細胞MMR活性。既往檢測細胞MMR功能的方法多使用細胞裂解后提取的蛋白(含錯配修復(fù)蛋白),比較費時費力,且不能測定活細胞MMR功能的實時變化。本方法能實時定量檢測活細胞 MMR功能的變化,適合于判斷雌激素對結(jié)腸細胞 MMR功能的影響。方法學上,為了確保觀察組和對照組細胞含EGFP基因的量基本相同,即EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后不再大量復(fù)制擴增,我們?nèi)コ藀EGFP-N1質(zhì)粒含SV40啟動子的片段。同時為了去除原有的野生型質(zhì)粒,確保轉(zhuǎn)染細胞的質(zhì)粒為新合成的異源/同源雙鏈質(zhì)粒,我們在 PCR定點誘變時加入了限制性酶切位點EcoRⅤ,且在合成寡核苷酸單鏈時未包含 EcoRⅤ酶切位點。轉(zhuǎn)入異源雙鏈質(zhì)粒后, SW 480細胞的錯配修復(fù)系統(tǒng)即可修復(fù)一部分轉(zhuǎn)入的含錯配啟動子的EGFP基因,修復(fù)成功后即表達正常的EGFP,可誘發(fā)綠色熒光;共轉(zhuǎn)的DsRed質(zhì)粒作為內(nèi)參,反映轉(zhuǎn)染效率;而轉(zhuǎn)入同源雙鏈質(zhì)粒的細胞,理論上誘發(fā)的熒光強度不受錯配修復(fù)系統(tǒng)影響,可作為對照得到EGFP相對表達值。

面對我國日益增加的大腸癌發(fā)病率和死亡率,本研究為雌激素類似物預(yù)防大腸癌的應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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