孟 雪,吳 春
(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,哈爾濱150076)
玉米苞葉為禾本科(Gramineae)玉米屬(zea)玉米(zea mays L)的苞葉,一年生草本植物,原產(chǎn)于拉丁美洲,在我國主要分布于北方和西南山區(qū).我國玉米資源豐富,但大量玉米苞葉被廢棄而并沒能得到有效利用.而玉米苞葉中含有豐富的具有抗衰老、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗糖尿病、護(hù)膚美容等作用的黃酮類物質(zhì)[1-2].大孔吸附樹脂是近十幾年發(fā)展起來的一類有機(jī)高分子聚合物吸附劑,近年來已廣泛應(yīng)用于各種植物和中草藥黃酮類化合物的分離純化過程,樹脂本身的性質(zhì)不同程度地影響著分離純化效果[3-6].本實(shí)驗(yàn)選用5種大孔樹脂對(duì)玉米苞葉黃酮粗提物進(jìn)行靜態(tài)吸附解吸,從中選出吸附容量大、易解吸的大孔樹脂,并對(duì)其純化的方法和條件做出了進(jìn)一步的研究,為今后工業(yè)化研究和開發(fā)玉米苞葉黃酮類產(chǎn)品奠定基礎(chǔ).
玉米苞葉(均采于黑龍江省雙城市同一地點(diǎn),經(jīng)洗凈、干燥、粉碎機(jī)粉碎、過40目篩等處理呈粉末狀);蘆丁對(duì)照品(中國醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司);纖維素酶(10 000 u/g);S-8、AB-8,X-5,H-103,NKA-9大孔樹脂(南開大學(xué)化工廠);其他化學(xué)試劑均為分析純或化學(xué)純.
DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司);植物粉碎機(jī)FZ102型(天津泰斯特儀器有限公司);電子天平FA2004N(上海精密科學(xué)儀器有限公司);PC-1000數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);SHZ-A水浴振蕩器(上海申勝生物技術(shù)有限公司);SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠);R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司);721E分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司).
2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.010 g,用無水乙醇溶解,定容至100 mL,得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液.分別準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL刻度試管中,加入5%NaNO2溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min后加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min后加入1 mol/LNaOH溶液4 mL,再用無水乙醇定容至刻度,搖勻后放置15 min,于510 nm處測(cè)定吸光度A(以第一管為測(cè)定空白).得到蘆丁質(zhì)量濃度(X)與吸光度(A)的回歸方程為A=8.7717X-0.0021 (R2=0.9998).
2.1.2 玉米苞葉總黃酮粗提物的制備及質(zhì)量濃度測(cè)定
稱取一定量的玉米苞葉粉末,在酶用量為1.5%,酶解溫度55℃,pH值為5.5的酶解條件下酶解1.5 h,減壓過濾,在濾渣中加入100 mL80%的乙醇,在70℃下水浴震蕩中提取4 h,減壓抽濾,將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無醇味,待測(cè)液的質(zhì)量濃度測(cè)定同標(biāo)準(zhǔn)曲線.
2.2.1 大孔樹脂的預(yù)處理
將市售樹脂用4倍體積的95%乙醇浸泡24 h,充分溶脹后,用乙醇清洗至流出液加適量蒸餾水無白色混濁現(xiàn)象.用蒸餾水洗至無醇,然后用5% HCl溶液浸泡12 h,用蒸餾水洗至中性;最后用5%NaOH溶液浸泡12 h,再用蒸餾水洗至中性,備用.
2.2.2 大孔樹脂的篩選
準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的五種樹脂(AB-8,S-8,X-5,H-103,NKA-9)1.0 g裝入具塞磨口錐形瓶中,加入玉米苞葉類黃酮水溶液(初始質(zhì)量濃度為0.310 mg/mL)17.5 mL,置恒溫水浴振蕩器上在25℃下振蕩24 h.使其達(dá)到飽和吸附,過濾,測(cè)定濾液中剩余黃酮質(zhì)量濃度,計(jì)算各樹脂25℃下的吸附率(%).然后將經(jīng)靜態(tài)吸附類黃酮后吸附飽和的樹脂濾出,吸干表面水分,加入95%的乙醇50 mL,置恒溫水浴振蕩器上25℃下振蕩24 h,過濾,測(cè)定濾液中類黃酮質(zhì)量濃度,計(jì)算各樹脂25℃下的解吸率(%).
2.2.3 靜態(tài)吸附與解吸動(dòng)力學(xué)曲線
稱取2 g樹脂于250 mL的三角瓶中,加入總黃酮質(zhì)量濃度為0.040 5 mg/mL的玉米苞葉總黃酮粗提液120 mL,室溫置于搖床上連續(xù)震蕩,每小時(shí)定時(shí)取樣,確定合理的吸附時(shí)間.取吸附飽和的樹脂,加入50%的乙醇100 mL,置于振蕩器上,每30 min測(cè)定黃酮質(zhì)量濃度,確定合理的解吸時(shí)間.
2.2.4 動(dòng)態(tài)工藝參數(shù)的考察
將處理好的樹脂濕法裝入內(nèi)徑為2 cm,長為60 cm的樹脂柱后,加入一定量的玉米苞葉總黃酮粗提液,調(diào)節(jié)流速,吸附一定時(shí)間后,先用蒸餾水沖洗去除多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì),再加一定質(zhì)量濃度的乙醇作為洗脫劑進(jìn)行洗脫,收集洗脫液,考察上樣流速、pH值、洗脫速率、洗脫劑體積分?jǐn)?shù)、洗脫流速等玉米苞葉總黃酮的參數(shù)的影響,優(yōu)化工藝.
2.2.5 玉米苞葉總黃酮提取物純度的測(cè)定
取5 g玉米苞葉粉末,用2.1.3的方法提取,濃縮,干燥成干膏,稱重.用醇稀釋溶解,測(cè)定黃酮含量,計(jì)算總黃酮純度.取上述溶液10 mL,揮去乙醇,并用水稀釋至20 mL,根據(jù)最佳工藝參數(shù)上柱、洗脫,收集乙醇洗脫液,濃縮,干燥稱重,再用稀醇溶解并定容25 mL,依前法測(cè)定并計(jì)算黃酮純度.
純度=C×V/M×100%
其中:C為純化后黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL),V為黃酮液體積(mL),M為黃酮物質(zhì)干重(mg).
從表1可以看出,由于樹脂的極性、孔徑、比表面、孔容等不同,不同類型樹脂對(duì)黃酮的吸附程度不同,綜合吸附率和解吸率兩個(gè)因素,S-8大孔樹脂不僅有較高的吸附率還有較高的解吸率,是比較好的吸附樹脂,更適合玉米苞葉總黃酮的研究,故選擇S-8大孔樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn).
表1 不同大孔樹脂對(duì)玉米苞葉總黃酮的吸附性質(zhì)測(cè)定結(jié)果
3.2.1 靜態(tài)吸附曲線
圖1顯示了S-8樹脂的吸附變化趨勢(shì),開始的一段時(shí)間內(nèi),S-8樹脂的吸附率在逐漸增加,隨著時(shí)間的延長,吸附量逐漸達(dá)到飽和.當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到5 h后,樣液質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化趨于平緩,即樹脂吸附已經(jīng)基本達(dá)到平衡.
圖1 大孔樹脂靜態(tài)吸附曲線
3.2.2 靜態(tài)解吸曲線
從圖2可以看出,開始一段時(shí)間內(nèi),黃酮的解吸逐漸增加;當(dāng)解吸時(shí)間達(dá)到1.5 h時(shí),解吸基本達(dá)到平衡.因此,S-8大孔樹脂對(duì)玉米苞葉黃酮的解吸時(shí)間為1.5 h.
圖2 表態(tài)解吸曲線
3.3.1 pH值對(duì)玉米苞葉總黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附量的影響
黃酮類化合物為多羥基酚類化合物,具有一定的極性和酸性,所以上柱液pH值對(duì)玉米苞葉黃酮類化合物的吸附效果會(huì)有一定影響.由圖3可知,當(dāng)上樣液pH值偏大時(shí),玉米苞葉總黃酮有離子化趨勢(shì)而不易被吸附,樣液pH值為4~5時(shí)大孔樹脂吸附量最大,因此,選擇pH值為4~5.
圖3 不同pH值對(duì)大孔樹脂吸附量的影響
3.3.2 上樣流速對(duì)吸附量的影響
圖4表明隨著上柱液流速的增加,吸附量下降,原因是吸附是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程,在相同的吸附速度下流速加快必然使相對(duì)吸附的時(shí)間減少,流速過快黃酮類化合物來不及擴(kuò)散到樹脂的內(nèi)表面而發(fā)生漏過,導(dǎo)致吸附率降低,故本實(shí)驗(yàn)選擇1 mL/min的速度上樣,從而提高其吸附率.
圖4 上樣流速對(duì)大孔樹脂吸附量的影響
3.3.3 洗脫速率對(duì)解吸率的影響
由圖5所示,解吸率隨著洗脫速率的增加逐步降低,但乙醇洗脫速率在1.5 mL/min和3.0 mL/ min時(shí)解吸率相差不大,考慮生產(chǎn)周期的問題,可以把洗脫速率定為3.0 mL/min.
圖5 洗脫速率對(duì)大孔樹脂解吸率的影響
3.3.4 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫率的影響
由圖6所示,在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%時(shí)解析率達(dá)到最高,然后開始下降,故選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的乙醇作為洗脫劑.
圖6 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)大孔樹脂解吸率的影響
由表2可知,S-8樹脂能提高玉米苞葉總黃酮的純度,純化后的黃酮純度為66.3%,工藝穩(wěn)定可行,純度提高3.5倍.
表2 樹脂純化前后的總黃酮純度
1)通過對(duì)5種大孔樹脂的靜態(tài)吸附研究,發(fā)現(xiàn)S-8型大孔樹脂是一種比較理想的樹脂,適合玉米苞葉黃酮的純化.
2)S-8大孔樹脂對(duì)玉米苞葉黃酮的吸附平衡時(shí)間為5 h,解吸平衡時(shí)間為1.5 h,最佳上柱pH值為4~5,以1.0 mL/min的吸附流速上樣,以3倍體積的蒸餾水沖洗再以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液進(jìn)行洗脫,洗脫用量100 mL,流速3 mL/min.
3)經(jīng)純化后的玉米苞葉總黃酮純度為66.3%.
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