江亞南,馬俊芬,黃幼田,李 沛,李芳芳,楊 浩,董子明#

1)鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理生理學教研室鄭州 450001 2)鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院臨床醫(yī)學系鄭州 450001

#通訊作者,男,1954年4月生,博士,教授,研究方向:食管癌DNA聚合酶β與癌變機制,E-mail:dongzm@zzu.edu.cn

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族中凋亡誘導(dǎo)成員中的一員,已被認為是腫瘤治療中新的生物制劑[1]。TRAIL主要通過誘導(dǎo)對其敏感的腫瘤細胞凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用,對正常細胞包括肝細胞和骨髓細胞幾乎無毒性。不同組織類型的癌細胞對TRAIL的敏感性不同,有研究[2]表明聯(lián)合化療或放療均可以明顯提高TRAIL對不敏感腫瘤細胞的凋亡誘導(dǎo)作用。該研究中作者通過TRAIL或順鉑(cDDP)單獨以及二者聯(lián)合應(yīng)用,觀察cDDP對TRAIL誘導(dǎo)食管癌EC1細胞凋亡的增敏作用,為TRAIL用于食管癌的生物治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 TRAIL購自美國R＆D公司,cDDP由山東齊魯制藥廠生產(chǎn),MTT購自美國Sigma公司,小牛血清購自天津TBD公司,RPMI 1640培養(yǎng)粉購自美國Gibco公司,二甲基亞砜購自美國Sigma公司。AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒購自寶賽生物公司,細胞周期試劑盒購自美國BD公司,碘化吡啶購自美國Sigma公司。EC1細胞系由香港大學曹世華教授惠贈。

1.2 細胞培養(yǎng) EC1細胞在含有體積分數(shù)10%的胎牛血清,100 U/m L青霉素,100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中,于37℃,體積分數(shù)為5%CO2孵箱中培養(yǎng)。0.2 g/L乙二胺四乙酸和0.5 g/L胰蛋白酶混合液消化、傳代、備用。

1.3 不同質(zhì)量濃度的TRAIL或cDDP作用不同時間對EC1細胞增殖的影響 采用MTT法。取處于對數(shù)生長期的細胞,調(diào)整細胞濃度為 4×104m L-1,接種于 96孔板。分別加入終質(zhì)量濃度為 0、10、50、100、500和 1 000μg/L的TRAIL及0、1.0、2.0、4.0、10.0和20.0 mg/L的cDDP,均設(shè)5個復(fù)孔。分別作用24、48和72 h后,每孔加入MTT 20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去上清,每孔加入 150μL二甲基亞砜,振蕩10min,在酶標儀上以空白對照孔調(diào)零,570 nm處讀取吸光度值(A)。細胞增殖率=(實驗孔平均A值/對照孔平均A值)×100%。

1.4 TRAIL與cDDP單用或聯(lián)用對EC1細胞凋亡的影響 取5×104個EC1細胞接種于培養(yǎng)瓶,以IC50cDDP(10.0mg/L)和治療劑量TRAIL(100μg/ L)單獨或聯(lián)合作用于EC1細胞,48 h后收集細胞,同時設(shè)未加藥物的空白對照組。PBS液洗滌 2遍,再用體積分數(shù)70%乙醇固定,4℃過夜,按AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒步驟操作,上流式細胞儀檢測細胞凋亡,分析細胞凋亡率。

1.5 TRAIL和cDDP單用或聯(lián)用對EC1細胞周期的影響 取EC1細胞,同1.4項分組處理后,用0.5 g/L胰蛋白酶消化,2 000 r/m in離心8 min,棄上清;用PBS洗2遍,離心后棄上清,加入體積分數(shù)70%冰乙醇固定,4℃過夜;上機前,2 000 r/ min離心8min,棄去乙醇,PBS洗2遍;加入1 mL PBS制成細胞懸液,按細胞周期試劑盒步驟操作,上流式細胞儀檢測細胞周期,每個樣本檢測 10 000個細胞。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 10.0進行分析。應(yīng)用 3×5析因設(shè)計的方差分析比較不同質(zhì)量濃度的TRAIL與cDDP作用不同時間對EC1細胞增殖的影響,應(yīng)用2×2析因設(shè)計的方差分析比較TRAIL或cDDP單用及聯(lián)用對EC1細胞凋亡和細胞周期的影響,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同質(zhì)量濃度TRA IL或cDDP作用不同時間對EC1細胞增殖的影響 見表 1、2。

表1 不同質(zhì)量濃度TRAIL作用不同時間對EC 1細胞增殖的影響(n=5) %

表2 不同質(zhì)量濃度cDDP作用不同時間對EC 1細胞增殖的影響(n=5) %

2.2 TRAIL與cDDP單用或聯(lián)用對EC1細胞凋亡率的影響 見表3。

表3 TRAIL與cDDP單用或聯(lián)用對EC 1細胞凋亡率的影響(n=5) %

2.3 TRA IL和cDDP單用或聯(lián)用對EC1細胞周期的影響 見表4～6。

表4 TRA IL和cDDP單用或聯(lián)用對EC 1細胞G0/G1期的影響(n=5) %

表5 TRA IL和cDDP單用或聯(lián)用對EC 1細胞G2/M期的影響(n=5) %

表6 TRA IL和cDDP單用或聯(lián)用對EC 1細胞S期的影響(n=5) %

3 討論

應(yīng)用細胞因子對腫瘤進行生物學治療是近年來國內(nèi)外學者研究的一個重要方向。TRAIL可以特異地誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而對正常細胞幾乎沒有作用,但是多種腫瘤細胞對其并不敏感[3-5]。該實驗結(jié)果顯示EC1細胞的增殖不隨TRAIL作用時間或質(zhì)量濃度的增加而改變,表明EC1對TRAIL并不敏感。如何增加食管癌EC1細胞對TRAIL的敏感性是TRAIL更好地應(yīng)用于食管癌臨床治療的關(guān)鍵問題。

有文獻[6-7]表明臨床常用化療藥物 cDDP和TRAIL聯(lián)用可以增加多種腫瘤細胞對TRAIL的敏感性。cDDP是目前食管癌化療中的常用藥物,具有廣泛的抗瘤譜。在大量或長期應(yīng)用后,常引起耳腎毒性及產(chǎn)生耐藥性而導(dǎo)致化療失敗[8-9]。該研究結(jié)果示cDDP對EC1細胞的增殖有抑制作用,且隨著cDDP作用時間和質(zhì)量濃度的增加而增強。作者將IC50cDDP和治療劑量的TRAIL聯(lián)合作用于EC1細胞48 h,結(jié)果顯示單用TRAIL對EC1細胞的凋亡影響不大,但是與cDDP聯(lián)合作用后,EC1細胞的凋亡率升高,表明cDDP對TRAIL誘導(dǎo)EC1細胞凋亡有增敏效應(yīng),為TRAIL用于食管癌的臨床治療提供了實驗依據(jù)。

細胞周期被阻滯于不同檢測點的意義不同:細胞阻滯在G1期檢查點,可防止DNA受損的細胞進入S期復(fù)制;阻滯在S期檢查點,可防止DNA復(fù)制不完全細胞進入 G2/M期;阻滯在G2期檢查點,防止在 M期進行異常分裂[9]。該研究結(jié)果顯示單用cDDP或TRAIL并不明顯影響EC1細胞周期,而二者聯(lián)合可將EC1細胞阻滯于G2/M期。具體機制有待于進一步研究。

[1]Jin H,Yang R,Fong S,et al.Apo2 ligand/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand cooperates with chemotherapy to inhibit orthotopic lung tumor grow th and improve survival[J].Cancer Res,2004,64(14):4900

[2]AshkenaziA,PaiRC,Fong S,etal.Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand[J].JClin Invest,1999,104(2):155

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[8]郝秀輕,張林西,孫黎,等.NS-398聯(lián)合順鉑對Eca-109細胞增殖及凋亡的影響[J].鄭州大學學報:醫(yī)學版,2010,45(5):713

[9]Kermp ler A,Deckbar D,Jeggop A,et al.An imperfect G2M checkpoint contributes to chromosome instability following irradiation of S and G2 phase cells[J].Cell Cycle, 2007,6(14):1682