溫文兵，劉淑萍

（河北理工大學(xué) 化工與生物技術(shù)學(xué)院，河北 唐山063009）

0 引 言

核桃青皮，中藥稱為青龍衣，是胡桃科植物胡桃楸的外果皮。其中含有含量較高的活性物質(zhì)胡桃醌（5-羥基-1，4-萘醌）。青龍衣與其他組織相比具有以下特點(diǎn)：1）青皮脫落后，其中的活性成分胡桃醌會抑制其他作物的生長，甚至殺死其他作物。2）核桃青皮中的含量較樹皮、葉中的含量高。孫墨瓏[1]采用超聲波法提取核桃楸中的胡桃醌，結(jié)果顯示，各組織中的含量為：樹皮中為0.131mg/g，青皮中0.229mg/g，葉中0.209 mg/g。3）青龍衣原料廉價(jià)，很多數(shù)地區(qū)為廢棄物，充分利用其中的活性物質(zhì)，可以有效地利用資源。

1 胡桃醌的穩(wěn)定性研究

季宇彬等考察了不同干燥方法對青龍衣中胡桃醌的含量的影響，結(jié)果表明，溫度越高，胡桃醌的含量越低，因此采用適當(dāng)?shù)暮娓煞椒▽阴奶崛∮兄匾挠绊?。同時(shí)，作者也考察了儲存時(shí)間、采摘時(shí)期對提取的影響。結(jié)果表明，儲藏時(shí)間越長，胡桃醌的含量越低，最佳采摘時(shí)間為八月份[2]。索緒斌等采用索式提取法提取核桃青皮中的胡桃醌，HPLC法檢測含量，結(jié)果顯示貯存年限對胡桃醌含量有很大的影響[3]。

表1 不同年份采集的樣品中胡桃醌的含量

孫墨瓏等對核桃楸乙醇提取物的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，以胡桃醌的降解率為指標(biāo)，考察了溫度、pH、光照等因素。結(jié)果表明，溫度越高，胡桃醌的降解率越大；pH在2和10時(shí)，降解率很大，在4-8之間較穩(wěn)定；光照時(shí)間越長，降解率越大；并且整體上，外果皮部分較葉和樹皮部分降解較大[4]。袁海艦對一系列物質(zhì)對胡桃醌的穩(wěn)定性影響，結(jié)果表明：H2O2、Na2SO3。吐溫80對胡桃醌的消減率有一定的影響；隨濃度的增加，胡桃醌的消減率加大；不同環(huán)境對胡桃醌的消減率也不相同，暗室避光為 65.17%，陽光下照射為83.81%，甲醇中為0.58%[5]。

2 胡桃醌的醫(yī)學(xué)研究

孫墨瓏介紹青龍衣對皮膚病、子宮脫垂、白細(xì)胞減少癥有良好的臨床療效、且有一定得鎮(zhèn)痛作用，其中的活性成分含有胡桃醌、粗萘醌鞣花酸和核桃多糖[6]。臨床實(shí)驗(yàn)表明，胡桃醌在一定濃度下對牙周炎的治療有很好的療效[7]。張野平等研究了胡桃醌對S180細(xì)胞的影響，對P388，P388／ADR及HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用和抑菌作用。結(jié)果顯示，胡桃醌對S180細(xì)胞在3小時(shí)內(nèi)影響很小，超過3小時(shí)后，隨濃度的增加，S180細(xì)胞細(xì)胞存活率有明顯下降；在一定濃度下，隨時(shí)間延長抑制作用增強(qiáng)。胡桃醌對腫瘤細(xì)胞P388，P388／ADR及HeLa細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，特別是對于阿霉素產(chǎn)生耐藥性的白血病細(xì)胞抑制效果較好。另外，應(yīng)用Paperdisc方法證明，胡桃醌對許多革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑制作用[8]。

胡桃醌對乳頭狀腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化的控制有明顯的效果[9]。有證據(jù)證明胡桃醌具有誘導(dǎo)突變的作用并且能夠致癌[10,11]。從山核桃楸中分離得到純晶體胡桃醌進(jìn)行醫(yī)學(xué)研究，結(jié)果表明該物質(zhì)具有對魚、老鼠、兔子等動物有鎮(zhèn)靜作用，它使兔子耳朵血管、心臟冠狀動脈膨脹，但它對狗的血壓和心率沒有影響，它還抑制小鼠腸和子宮的平滑肌的活動[12]。胡桃樹中天然毒性物質(zhì)胡桃醌，對培養(yǎng)液中人類細(xì)胞有不同程度的損傷作用。正常細(xì)胞對胡桃醌極其敏感，通過快速細(xì)胞凋亡和壞死而死亡。結(jié)果歸納為，胡桃醌對細(xì)胞有多種作用，包括DNA損壞、抑制轉(zhuǎn)錄、減少ph3蛋白質(zhì)水平以及誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[13]。

3 胡桃醌的生物活性研究

Guntram R von Kiparski等[14]通過測定土壤中胡桃醌濃度，說明核桃樹釋放的胡桃醌超過土壤中微生物和非生物的降解率，土壤中會有胡桃醌的積累，但這不意味著胡桃醌的濃度會不斷增加，因?yàn)槲⑸锏幕钚砸惨虼嗽黾樱沟媒到饴噬?。Sheng-Hao Chao等研究了胡桃醌對Pin1酶有一定的抑制作用，通過阻止RNA聚合酶Ⅱ的形成中斷轉(zhuǎn)錄。由于胡桃醌特異的抑制作用，其有希望用于體外轉(zhuǎn)錄研究[15]。通過水溶液培養(yǎng)液毒性測試，說明了胡桃醌對某些植物有潛在的毒性作用[16]。它在培養(yǎng)液中表現(xiàn)出毒性，具有抗病毒、抗細(xì)菌、抗真菌的性質(zhì)[17]。胡桃醌的毒性活動模型包括醌基和酚基官能團(tuán)對親核試劑的電子反應(yīng)活性以及具有能夠承受氧化還原能力的醌基和酚基[18]。

源自胡桃楸的胡桃醌從樹上到土壤的過程中，最初形態(tài)是相對無毒的α-羥基胡桃醌配糖，然后快速氧化成胡桃醌[19]。從胡桃楸中配糖物到胡桃醌分為兩步，土壤中β-葡萄糖甘酶催化水解成羥基胡桃醌，再快速氧化成醌型胡桃醌[20,21]。

4 青龍衣的化學(xué)成分

青龍衣中化學(xué)成分很多，不同的提取方法提取出的化學(xué)物質(zhì)不同。有機(jī)溶劑萃取方法，按類別劃分，青龍衣中含有萘醌類、酮類、醛類、酸類、醇類、呋喃等物質(zhì)。高小寧[22]用80%的乙醇回流提取青龍衣，通過反復(fù)硅膠層析、聚酰胺柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱分離得到9種化合物。β-谷甾醇、胡桃素、胡桃醌、核桃酮、胡桃酮、3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲酸、香草酸、山萘酚、槲皮素。經(jīng)GC-MS聯(lián)用技術(shù)表明了核桃青果皮氯仿、乙酸乙酯萃取相的化學(xué)組分。氯仿相得到 15種化合物，其中胡桃醌的含量最大，占到27.11%。按化合物種類分含有酯類5種，酚類3種，酮類2種，萘醌、呋喃、醇、醛、酸各1種。乙酸乙酯相得到24種化合物，其中，胡桃醌的含量最大，達(dá)到31.20%[23]。劉全宇[24]以95%乙醇回流提取青龍衣， H-NMR、C-NMR、IR等分析方法鑒別，確定5種化合物。分別為二十九烷醇、正三十一烷醇、正三十二烷醇、β-谷甾醇、D一葡萄糖。

5 胡桃醌的純化研究

袁海艦[5]用乙醇提取的浸膏分別用乙酸乙酯和氯仿萃取，通過鋪設(shè)薄層硅膠板，樣品跑板、展開劑展開，刮取與胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品相同Rf值的部分，經(jīng)HPLC分析，確定兩部分都有很高的純度。核桃楸的干燥青果皮經(jīng)80%乙醇提取，用氯仿萃取。萃取相以硅膠拌樣干法上樣，過80-120目的硅膠柱，石油醚、乙酸乙酯、甲醇按比例梯度洗脫，薄層檢識，合并餾分。其中一餾分經(jīng)200-300目硅膠柱層析、洗脫，再經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱純化得到胡桃醌純品120mg[22]。孫墨瓏[1]從核桃楸樹皮中提取胡桃醌，采用超聲波輔助浸提、減壓蒸餾和物理方法分離，重結(jié)晶得到純品胡桃醌，得率為0.09%，純度高達(dá)96.42%。

天然活性物質(zhì)與化學(xué)合成品的純化問題有所不同。首先，從植物或動物中提取的化合物化學(xué)成分很多情況下成分未知或者不穩(wěn)定，難以用排除法提純物質(zhì)。其次，提取多是采用溶劑提取或利用其他輔助手段如震動、回流、微波加熱等方式，這樣，粗品中相似結(jié)構(gòu)物質(zhì)必然提取出來，利用化學(xué)性質(zhì)很難純化。由于以上因素，大多天然活性物質(zhì)多采用各種色譜方法進(jìn)行純化。

6 胡桃醌的檢測方法

索緒斌等[3]采用高效液相色譜法對青龍衣中胡桃醌進(jìn)行經(jīng)檢測。固定相為定相為Shimpack-ODS反相色譜柱，流動相為甲醇-5%磷酸二氫鈉（3:1）。該法靈敏度高、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，加樣回收率為97.12%，RSD為1.17%。李福榮等[25]建立了HPLC法測青龍衣中胡桃醌的含量，使用Waters symmetry shieldTM RP18色譜柱，甲醇一水為流動相進(jìn)行梯度洗脫，在1～150g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，當(dāng)信噪比S／N= 10.04時(shí)，胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液定量限為5ng。孫墨瓏等[26]建立分光光度法測定核桃樹皮中胡桃醌的含量。用甲醇溶解樣品，426nm下檢測，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到樣品含量。該方法加樣回收率為99.6%，簡單易行，測定準(zhǔn)確。孫墨瓏等[27]通過減壓蒸餾等手段從核桃楸樹皮中提取分離出胡桃醌，經(jīng)GC-MS聯(lián)用分析得到胡桃醌相對含量高達(dá)96.42%。GC-MS采用了DB-17MS型毛細(xì)管色譜柱，氣化室溫度260℃，EI電離源。孫墨瓏[28]報(bào)道，對于單體成分的含量一般可用薄層掃描法測定，由于植物成分復(fù)雜，干擾比較大，很難達(dá)到完全分離的效果。伊朗學(xué)者Hadjmohammadi等[29]建立了RP-HPLC（反相高效液相色譜法）測定楓楊屬白蠟葉楓楊的葉和殼中胡桃醌的含量。采用C18色譜柱，流動相乙腈濃度為50%，磷酸鹽緩沖溶液pH為4，柱溫為30℃，流速1.5m l/min。在濃度0.015～0.240mg/m l范圍時(shí)，相關(guān)度分別為0.992和0.999，利用方程式計(jì)算得紫外檢測器的檢測限為1.03×10-4。

隨著癌癥治療呼聲的不斷升高，研究抗腫瘤藥物成為眾多科學(xué)家的研究對象。胡桃醌在醫(yī)學(xué)上的重要作用，特別是抗腫瘤作用，已成為目前的研究熱點(diǎn)。與此同時(shí)，從胡桃植物中，特別是從青龍衣中提取分離高純度的胡桃醌也成為很多學(xué)者研究的熱點(diǎn)課題。

[1] 孫墨瓏.核桃揪的殺蟲活性及活性成分研究[D].東北林業(yè)大學(xué)，2007，6.

[2] 季宇彬，陸婉，曲中原等.不同干燥方法、貯藏年限及采收時(shí)間對青龍衣中胡桃醌的影響[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2009，24（2）：110-112.

[3] 索緒斌，高奎濱，張?jiān)屏璧?高效液相色譜法測定青龍衣中胡桃醌含量[J].中藥材，2003，26（11）：793.

[4] 孫墨瓏，王艷梅，宋湛謙等.核桃楸乙醇提取物的穩(wěn)定性[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，36（5）：53-54.

[5] 袁海艦.核桃楸樹皮中活性物質(zhì)的提取與分析[D].東北林業(yè)大學(xué)，2007，6.

[6] 孫墨瓏.核桃楸化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，32（3）：85-86.

[7] Kim S H，Lee K S，Son J K，et al.Cytotoxic compounds from theroots of Juglans mandshurica[J].Nat Prod，1998，61（5）：643-645.

[8] 張野平，楊志博，景永奎等.胡桃醌對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用和抗菌作用[J].沈陽藥學(xué)院學(xué)報(bào)，1993，10（4）：271-274.

[9] Moks T J，Walker S E，F(xiàn)lynn L M，et al.Epidermal ornithine decarboxylase induction and mouse skin tumor promotion by quinines[J].Carcinogenesis，1990，11 (10)：1795-1801.

[10] Tikkanen L，Matsushima T, Natori S，et al.Mutagenicity of natural naphthoquinones and benzoquinones in the Salmonella/m icrosome test[J].Mutat. Res，1983，124，25-34.

[11] Sugie S，Okamoto K, Rahman K M，et al.Inhibitory effects of plumbagin and juglone on azoxymethane-induced intestinal carcinogenesis in rats.Cancer Lett， 1998，127，177-183.

[12] T K Auyong，B A Westfall，R L Russell.Pharmacological aspects of juglone[J].toxicon, 1963，1(4)：235-239.

[13] M ichelle T Paulsena，Mats Ljungman.The natural toxin juglone causes degradation of p53 and induces rapid H2AX phosphorylation and cell death in human fibroblasts[J].Toxicology and Applied Pharmacology，2005，209（1）：1-9.

[14] Guntram R von Kiparski，Linda S Lee， Andrew R Gillespie.Occurrance and Fate of the Phytotoxin Juglone in Alley Soils under Black Walnut Trees[J].ENVIRON. QUAL，2007，36：709-717.

[15] Sheng-Hao Chao，Arno L greenleaf， David H Price.Juglone，an inhibitor of the peptidyl-prolyl isomerase Pin1，also directly blocks transcription[J].Nucleic Acids Research，2001，29（3）：767-773.

[16] Hejl A M，and K L Koster.Juglone disrupts root plasma membrane H1-ATPase activity and impairs water uptake，root respiration and grow th in soybean (Glycine max) and corn (Zeamays) [J].Chem. Ecol，2004，30：453-471.

[17] Inbaraj J J，Chignell C F.Cytotoxic action of juglone and plumbagin：a mechanistic study using HaCaT keratinocytes[J].Chem. Res. Toxicol，2004，17, 55– 62.

[18] Rath M.C.，H. Pal and T. Mukherjee.One-electron transfer reactions of some hydroxynaphthoquinones: Solvent and substitution effect as studied by pulse radiolysis[J].Chem. Soc.，1996，F(xiàn)araday Trans. 92：1891-1897.

[19] Willis R.J..Juglans spp. Juglone，and allelopathy[J].A llelopathy，2000，7：1-55.

[20] Busto M.D. and M. Perez-Mateos.Characterization of Beta-d-glucosidase extracted from soil fractions[J]. Eur. J. Soil Sci.，2000，51：193-200.

[21] Duroux L.，F(xiàn). M. Delmotte， J. M. Lancelin，et al.Insight into naphthoquinone metabolism：Beta-glucosidase-catalysed hydrolysis of hydrojuglone beta-D-glucopyranoside[J].Bio-chem.，1998， 333：275-283.

[22] 高小寧.核桃楸青果皮化學(xué)成分的研究[D].蘇州大學(xué)，2008，5.

[23] 王艷梅.核桃楸青果皮生物活性及活性成分研究[D].東北林業(yè)大學(xué)，2008，6.

[24] 劉全宇.青龍衣化學(xué)成分的研究[D].黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2007，6.

[25] 李福榮，史衛(wèi)鋒，程國量等.HPLC法測定青龍衣中胡桃醌的含量[J].藥物研究，2007，4（12）：164-165.

[26] 孫墨瓏，袁海艦，宋湛謙等.分光光度法測定核桃楸樹皮中胡桃醌的含量[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，35（6）：37-38.

[27] 孫墨瓏，宋湛謙，方桂珍等.減壓蒸餾法提取核桃楸樹皮中的胡桃醌[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2007，27（6）：113-115.

[28] 孫墨瓏.植物有效成分的提取分離與定量分析[J].森林工程，2003，19（4）：16-17.

[29] Hadjmohammadi，Mohammad Reza，Kamel，et al.Determ ination of Juglone (5-hydroxy 1,4-naphthoquinone) in Pterocarya fraxinifolia by RP-HPLC[J].iran. j.chem.chem.eng，2006，25（4）：73-76.