夏軼男 劉 敩 蔡 郁 于廣池 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 3004)
化療增敏劑通過(guò)逆轉(zhuǎn)腫瘤組織耐藥,干擾腫瘤細(xì)胞與組織微環(huán)境間耐藥信號(hào)傳導(dǎo)等提高化療效果。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用辛可寧、瑞米酚、酚塞嗪等藥物作為化療增敏劑,聯(lián)合化療藥物應(yīng)用,提高臨床治療效果〔1,2〕。本研究觀察鹽酸氯丙嗪聯(lián)合欖香烯制劑對(duì)人喉癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞的增殖抑制率、細(xì)胞周期進(jìn)程和凋亡率的影響,為喉癌化療增敏劑的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1.1 細(xì)胞株與試劑 Hep-2細(xì)胞株由吉林省腫瘤研究所惠贈(zèng),欖香烯乳注射液(大連金港制藥有限公司生產(chǎn));噻唑藍(lán)(MTT)試劑,RPMⅠ1640培養(yǎng)基(Sigma公司);胎牛血清(長(zhǎng)春生物制品研究所)。
1.2 方法
1.2.1 MTT比色法 單純欖香烯組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞,調(diào)細(xì)胞數(shù)為2×105/ml,接種于96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi),每孔100 μl,靜止培養(yǎng) 12 h后每孔內(nèi)分別加入25、50、100 μg/ml欖香烯制劑,每個(gè)濃度10復(fù)孔,靜止培養(yǎng)24 h,于結(jié)束前6 h,每孔內(nèi)分別加入MTT試劑20μl/孔,終濃度為50 mg/L,繼續(xù)培養(yǎng)6 h后,吸棄上清,加入二甲基亞砜150μl/孔,振蕩10 min,使MTT還原產(chǎn)物完全溶解,于酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)量各孔吸光度A值,按下列公式計(jì)算不同濃度欖香烯制劑對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖抑制率的影響。
Hep-2細(xì)胞抑制率=(1-加藥孔細(xì)胞A值÷對(duì)照孔細(xì)胞A值)×100%
1.2.2 聯(lián)合組 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,取欖香烯50μg/ml加入鹽酸氯丙嗪4 mg/ml,實(shí)驗(yàn)條件同1.2.1。
1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期進(jìn)程及凋亡率 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2.1,不同之處是將96孔塑料培養(yǎng)板改為25 ml培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)結(jié)束后,分別收集經(jīng)不同條件作用后的Hep-2細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次,離心棄上清,細(xì)胞經(jīng)70%冷乙醇固定,4℃保存,上機(jī)前過(guò)40目網(wǎng),調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×106/ml,碘化丙啶(PⅠ)染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0軟件,計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示,細(xì)胞增殖抑制率組間比較采用t檢驗(yàn),細(xì)胞周期組間比較采用F檢驗(yàn)。
2.1 Hep-2細(xì)胞增殖抑制率 MTT結(jié)果顯示單純欖香烯組(25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml)Hep-2 細(xì)胞增殖抑制率分別為14.0%、23.9%和28.6%,與對(duì)照組相比差異顯著;而聯(lián)合組,即50μg/ml欖香烯與4 mg/ml氯丙嗪組對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖抑制率為39.2%,抑制效果優(yōu)于100μl/ml欖香烯組,具有良好的增敏作用。
2.2 Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程及凋亡率 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示單純欖香烯組隨著欖香烯濃度的增加,G0/G1期細(xì)胞增多,S期細(xì)胞減少,而G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多,細(xì)胞凋亡率升高;而聯(lián)合組即50μg/ml欖香烯與4 mg/ml氯丙嗪組效果更為明顯。見(jiàn)表1,表 2。
表1 不同濃度欖香烯制劑對(duì)Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程及凋亡的影響(±s,%/24 h)
表1 不同濃度欖香烯制劑對(duì)Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程及凋亡的影響(±s,%/24 h)
與0μg/ml組比較:1)P<0.05,2)P<0.01
組別 G0/G1 S G2/M 凋亡率(%)0 μg/ml組29.4±2.1 61.2±4.7 8.7±1.5 0.3 25μg/ml組 45.8±4.41)38.1±4.12)16.1±2.91) 7.62)50μg/ml組 53.3±3.62)27.8±4.72)18.8±3.22) 12.62)100μg/ml組 62.2±5.12)15.9±2.22)21.5±3.62) 17.32)
表2 單純欖香烯組與聯(lián)合組對(duì)Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞凋亡率的影響(±s,%/24 h)
表2 單純欖香烯組與聯(lián)合組對(duì)Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞凋亡率的影響(±s,%/24 h)
與欖香烯組比較:1)P<0.05,2)P<0.01
組別 G0/G1 S G2/M 凋亡率(%)欖香烯組53.3±3.6 27.8±4.7 18.8±3.2 12.6聯(lián)合組 68.6±5.41) 9.5±2.12) 21.5±2.61) 17.32)
化療增敏劑是指沒(méi)有抗腫瘤作用,但能提高已知有抗腫瘤作用藥物的化療效果,增強(qiáng)抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷或降低其對(duì)正常組織細(xì)胞毒性的一類藥物〔3〕。本研究應(yīng)用MTT比色法觀察欖香烯聯(lián)合氯丙嗪對(duì)Hep-2細(xì)胞的增殖抑制作用。欖香烯是國(guó)家二類非細(xì)胞毒性抗腫瘤新藥,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床證明對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用〔4〕;且毒副作用小,抗腫瘤譜廣,價(jià)格低廉,具有廣闊應(yīng)用前景。氯丙嗪屬于酚噻嗪類化合物,是鈣調(diào)蛋白抑制劑,與化療藥物合用后顯著改變化療藥物的藥代動(dòng)力學(xué)機(jī)制〔5〕。MTT結(jié)果顯示,不同濃度的欖香烯制劑對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖抑制率均有影響,與對(duì)照組相比差異顯著,尤其在50μg/ml欖香烯組增加4 mg/ml鹽酸氯丙嗪后,極大提高了對(duì)Hep-2細(xì)胞的增殖抑制效果,抑制率由23.9%升高至39.2%。因?yàn)镸TT試劑可被哺乳動(dòng)物活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原成藍(lán)色的甲臜顆粒,且甲臜生成的量與活細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活化狀態(tài)呈線性關(guān)系。所以,該方法被廣泛用于抗腫瘤藥物的篩選和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究的客觀指標(biāo)。
本研究還應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的欖香烯對(duì)Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程的影響,結(jié)果表明,欖香烯能夠抑制Hep-2細(xì)胞G1期向S期細(xì)胞轉(zhuǎn)化進(jìn)程,從而使G1期細(xì)胞增多,S期細(xì)胞減少,造成G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多,而G2/M期細(xì)胞增多是細(xì)胞損傷的普遍反應(yīng),這一點(diǎn)從細(xì)胞凋亡率上得到體現(xiàn)。G1期細(xì)胞是指細(xì)胞從有絲分裂到DNA復(fù)制之前,G1期是制造和產(chǎn)生mRNA、rRNA、tRNA及核蛋白體的階段,而且G1期也是藥物作用的敏感點(diǎn)〔6〕。因此,抑制G1期的RNA合成,可間接地使腫瘤細(xì)胞合成減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,欖香烯聯(lián)合氯丙嗪能顯著抑制G1期向S期轉(zhuǎn)化,造成G1期細(xì)胞堆積,不能進(jìn)入S期,從而使細(xì)胞增殖變緩,達(dá)到抑制腫瘤增殖的目的。
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4 周洪語(yǔ),侯菊生,王 勇,等.欖香烯誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的劑量和時(shí)間依賴性研究〔J〕.中華腫瘤雜志,2006;28(4):270-1.
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