李逸龍

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，泰安，271018）

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最基本和最關(guān)鍵的生產(chǎn)資料，其純度的高低是衡量種子質(zhì)量優(yōu)劣的主要指標(biāo)，我國對不同作物種子的純度進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定。種子純度降低會顯著降低作物的產(chǎn)量和產(chǎn)品品質(zhì)。當(dāng)前我國農(nóng)作物種子純度低劣狀況普遍存在，以玉米為例，1994年抽檢了88個樣品，合格率為0，種子純度在90%以上的僅占14.8%，純度最低的只有59.5%；1995年抽檢了63個樣品，合格樣品1份，占1.6%，純度在90%以上的占23.8%，純度最低的為73.2%。而研究表明，種子純度為96.5%和95.6%的玉米比純度為98.6%的分別減產(chǎn)10.5%和11.1%[1]。因此，提高種子純度是保證農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的基礎(chǔ)，對農(nóng)作物的大田生產(chǎn)和質(zhì)量監(jiān)督起決定作用。在我國，種子純度低的原因主要有2個，一是由種子生產(chǎn)、收獲、脫粒、加工、運(yùn)輸?shù)冗^程中的生物混雜和機(jī)械混雜造成的；二是一些繁種單位或個人為了片面追求經(jīng)濟(jì)效益而忽視種子質(zhì)量，甚至摻雜使假，導(dǎo)致種子純度降低。種子純度降低會使農(nóng)民蒙受巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]，所以我國不斷地對種子的純度進(jìn)行調(diào)整和嚴(yán)格規(guī)定，加大對種子企業(yè)的監(jiān)管和懲罰力度，以保證廣大農(nóng)民的利益，促進(jìn)農(nóng)業(yè)市場的健康發(fā)展，增強(qiáng)企業(yè)競爭力。

1 農(nóng)作物種子純度檢驗(yàn)的含義及意義

種子純度的檢驗(yàn)應(yīng)包括兩方面內(nèi)容，即種子的真實(shí)性和品種純度。種子的真實(shí)性是指供檢品種與文件記錄是否相符。品種純度是指品種典型特性一致的程度。品種純度檢驗(yàn)的對象可以是種子、幼苗或比較成熟的植株。我國的《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》中明確指出，當(dāng)送驗(yàn)者對報檢的種或品種已有說明，并且具有一個可供比較的、可靠的標(biāo)準(zhǔn)樣品時，品種純度的鑒定才是有效的。

種子的真實(shí)性和品種純度是保證良種優(yōu)良遺傳特性得以充分發(fā)揮的前提，是正確評定種子等級的重要指標(biāo)。種子純度在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和種子生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價值，在品種登記管理、品種產(chǎn)權(quán)保護(hù)、品種親緣關(guān)系研究以及遺產(chǎn)多樣性研究中都有很高的應(yīng)用價值[4]。

2 農(nóng)作物種子純度檢驗(yàn)的理論依據(jù)

伴隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)的不斷發(fā)展，種子純度鑒定技術(shù)由傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記鑒定逐步發(fā)展到集形態(tài)標(biāo)記鑒定、生化標(biāo)記鑒定和DNA分子標(biāo)記鑒定為一體的綜合鑒定技術(shù)體系。根據(jù)種子純度檢驗(yàn)的發(fā)展歷史和植物性狀的表現(xiàn)差異，將農(nóng)作物種子純度的檢驗(yàn)分為2個階段。第1個階段為形態(tài)性狀方面的差異（也可稱為形態(tài)標(biāo)記），如種子的形狀、種皮色澤，幼苗芽鞘色澤，成株期株形、株高、開展度，葉片形狀、葉色、花色、果形、果色、產(chǎn)量等，這些標(biāo)記性狀是基因在形態(tài)方面的表達(dá)，可以直接通過觀察鑒定。第2個階段分為2個部分，一是生物化學(xué)成分方面的差異（也可稱為生化標(biāo)記），如蛋白質(zhì)、同工酶的差異，這些生化差異是不同基因表達(dá)的產(chǎn)物，通常不能直接通過觀察鑒定，必須采用一定的技術(shù)加以分析鑒定；二是調(diào)控品種性狀本身的遺傳物質(zhì)的差異 （稱為DNA分子標(biāo)記），DNA分子標(biāo)記鑒定方法同樣需要一定的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和儀器，因其準(zhǔn)確度高被廣泛認(rèn)可?，F(xiàn)在對種子純度的鑒定往往是采用形態(tài)鑒定與生化或分子鑒定相結(jié)合的方法。

根據(jù)種子純度檢驗(yàn)法所依據(jù)的原理、檢驗(yàn)對象的不同，還有其他多種檢驗(yàn)方法。雖然鑒定品種純度的方法很多，但在實(shí)際生產(chǎn)中能廣泛應(yīng)用的方法較少。我們現(xiàn)在主要的鑒定手段和方法多以我國標(biāo)準(zhǔn)和國際標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，具有廣泛的實(shí)用性和適用性。

3 農(nóng)作物種子純度檢驗(yàn)技術(shù)研究進(jìn)展

3.1 以形態(tài)標(biāo)記為依據(jù)的檢驗(yàn)技術(shù)

根據(jù)某一品種的種子、幼苗、成株具有區(qū)別于其他品種的形態(tài)特征來檢驗(yàn)該品種種子的純度。該方法應(yīng)用最早、最廣泛，并且目前仍是農(nóng)作物種子純度檢驗(yàn)的主要方法，主要包括種子形態(tài)鑒定法、幼苗形態(tài)鑒定法和田間小區(qū)種植鑒定法。

①種子形態(tài)鑒定法 是指檢驗(yàn)人員用放大鏡或是解剖鏡等一些專用的檢測工具，根據(jù)不同作物品種種子特定的外觀形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。如鑒定玉米種子，其粒形有圓粒、扁粒、長粒之分；類型有馬齒型、半馬齒型、硬粒型之分；色澤有白、淺黃、橙黃、淺紅、紫色之分等。種子形態(tài)鑒定法適宜種子形態(tài)特征變化類型豐富的作物如玉米、水稻、豆類等，該法簡單、方便、直觀、成本低。其缺點(diǎn)是：a.難以區(qū)分種子形態(tài)特征差異較小的作物品種，如十字花科的大部分蔬菜、茄果類蔬菜等；b.種子的有些形態(tài)特征易受到環(huán)境條件的影響，如種子大小、色澤與種子的成熟度有關(guān)，因而會影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性；c.鑒定結(jié)果受鑒定人員的主觀影響，鑒定者不同或水平不同均會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。所以此方法檢驗(yàn)的結(jié)果可靠性不夠高、適用范圍較狹窄[4]。同時，目前新品種多由數(shù)量有限的優(yōu)良親本經(jīng)雜交育成，其遺傳變異性狀日趨狹窄，導(dǎo)致品種之間的形態(tài)學(xué)差異越來越小，且形態(tài)學(xué)鑒定方法通常需要2～3個生長周期，使得從形態(tài)上鑒定種子的純度差異變得越來越困難[5]。

②幼苗形態(tài)鑒定法 按要求取一定數(shù)量的種子，在溫室或人工氣候箱中培養(yǎng)成幼苗，當(dāng)幼苗達(dá)到適宜評價的發(fā)育階段時，根據(jù)幼苗具有的形態(tài)特征進(jìn)行純度檢驗(yàn)。如根據(jù)水稻、小麥、玉米葉鞘的顏色（紅、綠、紫），番茄、茄子胚軸的顏色，葉片顏色，葉片形狀等特征區(qū)別品種。對于具有上述特征差異明顯的作物品種鑒定的準(zhǔn)確性較高，檢驗(yàn)所需的設(shè)備簡單、易于操作、成本較低。但對于遺傳差異不大、形態(tài)特征相似的品種鑒定的準(zhǔn)確性較差，并且不同品種對處理時期和處理程度較為敏感，其他缺點(diǎn)同種子形態(tài)鑒定法。

③田間小區(qū)種植鑒定法 將樣品在田間播種，對作物進(jìn)行統(tǒng)一的栽培和管理，然后根據(jù)植株不同時期的表現(xiàn)特征進(jìn)行鑒定，尤其是作物生長關(guān)鍵時期的性狀，如玉米的抽穗期、花期與成熟期，各種性狀已充分顯現(xiàn)，因此鑒定結(jié)果相對比較準(zhǔn)確、可靠。但是，一方面，受時間長、用地較多、成本高等因素的限制，該鑒定方法難以鑒定當(dāng)年生產(chǎn)的種子的純度，不利于種子的收購定級和調(diào)運(yùn)；另一方面，受環(huán)境條件和栽培手段的影響，如遇上外界自然災(zāi)害，可能對鑒定結(jié)果產(chǎn)生不利影響。

3.2 以生化標(biāo)記為依據(jù)的檢驗(yàn)技術(shù)

主要是利用電泳技術(shù)對不同品種因基因水平的差異而引起的功能蛋白質(zhì)種類、結(jié)構(gòu)、數(shù)量的變化進(jìn)行比較。生化標(biāo)記鑒定法可分為同工酶電泳法和蛋白質(zhì)電泳法。這種利用生化指標(biāo)檢測種子純度的方法具有快捷、成本低、易于普及的特點(diǎn)，結(jié)果也比較客觀，不易受鑒定者主觀因素的影響。張承毅等[6]利用蛋白質(zhì)電泳法對大白菜種子樣品進(jìn)行分析，找到了晉菜3號、魯白1號2個雜交組合的雜交互補(bǔ)帶，并成功應(yīng)用于大白菜種子純度的檢驗(yàn)。

我國已建立了一套比較完整的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)體系，并成功應(yīng)用于水稻、玉米、大麥、小麥、棉花、煙草、豌豆、蒜、蔥等農(nóng)作物的品種鑒定中。其中，大麥和小麥品種的醇溶蛋白電泳、豌豆屬和黑麥草屬的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）以及玉米屬的醇溶蛋白超薄等電聚集（IEF）技術(shù)已列于國家種子規(guī)程之中。小麥醇溶蛋白電泳技術(shù)和玉米鹽溶蛋白質(zhì)電泳鑒定方法，已分別列于《中華人民共和國農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)章制度》和《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》。

盡管同工酶和蛋白質(zhì)電泳法越來越多地在農(nóng)作物種子純度研究領(lǐng)域中得到應(yīng)用，其優(yōu)點(diǎn)已得到多方的贊同，但是其也有不足之處。例如某些遺傳組成非常接近的品種，不易找到其父母本的特異蛋白，采用蛋白質(zhì)電泳發(fā)難以發(fā)現(xiàn)特征帶；若制種所用親本不純、含有多個姊妹系或自交系在繁殖過程中發(fā)生變異，其蛋白質(zhì)譜帶帶型不同，導(dǎo)致無法對其雜交種電泳時表現(xiàn)出的多種帶型進(jìn)行判定。此外蛋白質(zhì)變異位點(diǎn)有限，蛋白質(zhì)多態(tài)性有較嚴(yán)格的組織與時間表達(dá)特異性，要求其蛋白產(chǎn)物易提取且易通過電泳來檢測。同時蛋白質(zhì)或同功酶極不穩(wěn)定，受環(huán)境影響較大。正是上述問題導(dǎo)致了蛋白質(zhì)與同功酶技術(shù)應(yīng)用的局限性。

3.3 以DNA分子標(biāo)記為依據(jù)的檢驗(yàn)技術(shù)

在生物基因組中，DNA因存在倒位、易位、插入、缺失、轉(zhuǎn)座或排列不一的重復(fù)序列的現(xiàn)象，而表現(xiàn)出多態(tài)性。DNA分子標(biāo)記是指生物基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增或兩者結(jié)合等措施處理后電泳，以電泳譜帶的形式表現(xiàn)DNA的多態(tài)性，這種多態(tài)性在本質(zhì)上反映了生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段。以DNA標(biāo)記為依據(jù)的檢驗(yàn)技術(shù)鑒定種子純度就是以DNA分子的多態(tài)性即DNA堿基排列順序的差異性為基礎(chǔ)。自從20世紀(jì)70年代最早提出RFLP方法以來，在10多a間出現(xiàn)了許多DNA標(biāo)記檢測技術(shù)，概括起來可分為兩類：一類是以Southern轉(zhuǎn)移和分子雜交為基礎(chǔ)的技術(shù)，如RFLP；另一類是以PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)，如RAPD、AFLP、SSR等。下面就幾種主要技術(shù)作一介紹。

①RFLP技術(shù) 是最早也是經(jīng)典的DNA分子標(biāo)記鑒定技術(shù)。它是根據(jù)不同基因組的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)堿基突變、酶切位點(diǎn)之間發(fā)生了堿基的插入或缺失而導(dǎo)致酶切片段的大小發(fā)生變化，通過特定的探針與酶切片段雜交，檢測不同位點(diǎn)的等位變異，從而比較不同品種在DNA水平上的差異，以此來鑒別真假種子。其技術(shù)流程主要包括基因組DNA的提取、DNA的酶切、電泳分離、Southern轉(zhuǎn)移、探針標(biāo)記（同位素或非同位素標(biāo)記）、DNA分子雜交、多態(tài)性片段的檢測等。Matsuura等[7]利用RFLP克隆區(qū)分黃瓜親本NBl、GFl及其F1代雜交種，發(fā)現(xiàn)利用RFLP分析可快速檢測黃瓜雜交一代種子的純度。

RFLP標(biāo)記技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：a.無表型效應(yīng)；b.呈典型的孟德爾式遺傳；c.在非等位的RFLP標(biāo)記之間不存在上位效應(yīng)，互不干擾。缺點(diǎn)：a.DNA用量大；b.操作煩瑣，技術(shù)復(fù)雜，工作量大；c.有放射性為害。RFLP標(biāo)記技術(shù)在國內(nèi)研究較少，近年來缺乏相關(guān)報道。

②RAPD技術(shù) 1990年由Williams在PCR的基礎(chǔ)上發(fā)明的一種最簡單的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。技術(shù)核心是用人工合成的隨機(jī)引物（10 bp）對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生多態(tài)性DNA片段，經(jīng)電泳分離和EB染色，獲取DNA多態(tài)信息。其技術(shù)流程包括基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增、標(biāo)記的檢測等。由于該技術(shù)成本相對比較低廉、操作簡單、可選擇的引物多、檢測到的多態(tài)性位點(diǎn)較多、不受環(huán)境條件的影響，克服了形態(tài)學(xué)鑒定和生化標(biāo)記檢驗(yàn)法的不足，因此該技術(shù)一出現(xiàn)便被廣泛應(yīng)用于種子純度的檢驗(yàn)。黃三文等[8]篩選出12個較穩(wěn)定的RAPD標(biāo)記，可以用于中椒系列辣椒的9個雜交種的純度鑒定；宋順華等[9]應(yīng)用RAPD標(biāo)記鑒定大白菜雜種商品種子的純度，用50個隨機(jī)引物檢測了2個雜交種及其親本，其中有3個引物能清楚地區(qū)分雜交種及其雙親；莫結(jié)勝等[10]用RAPD標(biāo)記檢測雜交油葵A15種子純度，引物OPD09、OPD12、OPK12不僅能鑒定出雜種及混雜的親本種子，還能將與A15外型相近的大部分雜交種區(qū)別開來。

RAPD標(biāo)記技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：a.可以對任何沒有分子生物學(xué)基礎(chǔ)信息的物種進(jìn)行DNA多態(tài)性分析；b.與RFLP的作用類似，但其檢測效率更高、樣品用量更少、靈敏度更高等；c.以PCR為基礎(chǔ)，但又比PCR方便。但RAPD技術(shù)也有其不足之處，一是對其穩(wěn)定性一直有很多的爭論，特別是不同實(shí)驗(yàn)室之間的重演性較差；二是RAPD標(biāo)記為顯性標(biāo)記，雜交種與親本之一的帶型有可能完全相同，如用單一引物便不能從這一位點(diǎn)區(qū)分是雜交種還是親本，因此必須選用能反映2個位點(diǎn)差異的引物進(jìn)行擴(kuò)增；三是對模板DNA的純度要求高。從總體上講，RAPD技術(shù)適合我國大多數(shù)檢測單位，是比較理想的種子純度鑒定方法，在我國農(nóng)作物種子純度檢驗(yàn)中發(fā)揮著重要作用。

③AFLP技術(shù) 1995年由Zabeau發(fā)明的一種檢測DNA分子標(biāo)記能力極強(qiáng)的技術(shù)。其原理是對基因組DNA酶切片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，經(jīng)電泳分離和銀染，獲取DNA的多態(tài)信息。其主要操作流程為基因組DNA的提取、酶切、接頭的連接、預(yù)擴(kuò)增（PCRⅠ）、選擇性擴(kuò)增（Ⅱ）、電泳分離、銀染檢測等。該技術(shù)避免了RFLP和RAPD的缺點(diǎn)，同時結(jié)合了兩者的優(yōu)點(diǎn)，其分辨率高、重演性好、多態(tài)性豐富，從某種意義上說，AFLP技術(shù)的出現(xiàn)是DNA分子標(biāo)記檢測技術(shù)的重大突破。田雷等[11]對AFLP標(biāo)記技術(shù)在大白菜種子真實(shí)性及品種純度鑒定中的應(yīng)用效果進(jìn)行了探討，利用某引物組合擴(kuò)增出的DNA圖譜可以將供試的5個雜交種及其8個親本全部區(qū)分開，從而可用此引物組合來鑒定雜交種和進(jìn)行親本純度的鑒定；田雷等[12]還利用AFLP方法對5個甘藍(lán)雜交組合及其10個親本共15個材料進(jìn)行了分析研究，從32個引物組合中篩選出1個引物組合，能夠?qū)?個供試甘藍(lán)雜交種的真實(shí)性及品種純度進(jìn)行鑒定，從而證明了AFLP技術(shù)在甘藍(lán)種子真實(shí)性及品種純度鑒定中的可行性。

AFLP標(biāo)記技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：a.標(biāo)記異常豐富，典型的AFLP反應(yīng)中，1次可檢測 100～150個擴(kuò)增產(chǎn)物；b.穩(wěn)定性、重復(fù)性、共顯性表達(dá)，不受環(huán)境影響，無復(fù)等位效應(yīng)；c.多態(tài)性很少、待測樣品也較少的情況下（如近等基因系和BSA分析）用AFLP標(biāo)記能達(dá)滿意的結(jié)果；d.帶紋豐富，靈敏度高，快速高效。但是，AFLP標(biāo)記也有缺點(diǎn)：a.其是一種專利技術(shù)，受專利權(quán)保護(hù)；b.實(shí)驗(yàn)操作難度大，基因組的不完全酶切會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以實(shí)驗(yàn)對DNA純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求較高，需同位素或非同位素標(biāo)記引物，昂貴費(fèi)時，一般實(shí)驗(yàn)室難以完成。因此在短時間內(nèi)很難推廣應(yīng)用在種子的純度檢驗(yàn)上。從長遠(yuǎn)看，AFLP是一種很有希望的種子純度檢驗(yàn)技術(shù)。

④SSR技術(shù) 在動植物基因組中分布著許多1~10 bp的簡單重復(fù)序列（SSR），由于不同種或品種間重復(fù)單位的數(shù)目及重復(fù)單位序列的差異使基因組DNA產(chǎn)生大量的多態(tài)性。其技術(shù)流程包括基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增、電泳分離、多態(tài)性檢測等。該技術(shù)比RFLP檢測到的多態(tài)性要多得多，并且減少了酶切、探針制備和DNA分子雜交等繁瑣程序，也是一種較為理想的DNA標(biāo)記技術(shù)。到目前為止，SSR技術(shù)已在許多作物品種鑒定和純度檢測上得到應(yīng)用。劉勤紅等[13]篩選了217對異源四倍體棉花的SSR引物，獲得了十幾個足以區(qū)分魯棉研15號父母本及其F1代的顯性標(biāo)記位點(diǎn)，為魯棉研15號雜交種的純度鑒定提供了一個準(zhǔn)確、穩(wěn)定和快捷、實(shí)用的方法；蘇順宗等[14]篩選出一批在常規(guī)水稻親本上具有較高多態(tài)性的SSR引物，并與田間純度鑒定結(jié)果進(jìn)行研究比較，結(jié)果表明，SSR鑒定的平均純度與田間鑒定結(jié)果無顯著性差異，SSR可以用于雜交水稻種子純度的鑒定；李曉結(jié)合單籽粒DNA快速提取方法，快捷、準(zhǔn)確地鑒定了玉米雜交種蜀雜6號的種子純度；王風(fēng)格等[15]從DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳檢測等環(huán)節(jié)對SSR技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，最終建立了一套完善的適用于玉米品種鑒定的SSR標(biāo)準(zhǔn)體系。

SSR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：a.數(shù)量豐富，覆蓋整個染色體組；b.具有多等位基因特性，信息含量高；c.以孟德爾方式遺傳，呈共顯性；d.易于利用PCR技術(shù)分析，對DNA數(shù)量及純度要求不高，結(jié)果重復(fù)性好；e.每個位點(diǎn)由引物序列順序決定，便于交換。SSR技術(shù)最大的缺點(diǎn)是必須對重復(fù)序列兩端的保守序列進(jìn)行尋找和分析，從而設(shè)計出同兩端保守序列互補(bǔ)的引物，這限制了該技術(shù)在大多數(shù)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)中的普及應(yīng)用[16]。但一旦開發(fā)出一套某種生物的微衛(wèi)星標(biāo)記，其他的研究工作者將受益無窮。

4 總結(jié)及展望

形態(tài)標(biāo)記鑒定法作為經(jīng)典傳統(tǒng)的鑒定方法，現(xiàn)階段仍是國內(nèi)應(yīng)用最廣泛和最方便的種子純度鑒定方法，隨著科學(xué)的不斷發(fā)展，這種傳統(tǒng)方法自身也在不斷完善和改進(jìn)，但是受人為因素限制和外在環(huán)境影響，形態(tài)鑒定法發(fā)展的空間有限，在未來只能通過不斷地修訂和改進(jìn)，獲得有限的進(jìn)步。生化標(biāo)記鑒定法和DNA分子標(biāo)記鑒定法作為較為領(lǐng)先的種子純度鑒定技術(shù)，擁有更加廣闊的發(fā)展空間，是更加準(zhǔn)確的鑒定方法。但是受現(xiàn)階段科學(xué)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)水平的限制，生化標(biāo)記鑒定和DNA分子標(biāo)記鑒定仍未能被廣泛利用在實(shí)踐生產(chǎn)中，在不久的將來，其有可能替代傳統(tǒng)的鑒定方法，并且更廣泛地應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。

綜上，每一種方法都有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)，至今還沒有一種鑒定方法能夠比較全面、準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)地進(jìn)行種子純度檢驗(yàn)。所以，現(xiàn)階段的種子純度鑒定仍然是以形態(tài)標(biāo)記、生化標(biāo)記和DNA分子標(biāo)記結(jié)合進(jìn)行綜合的鑒定。

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