陳俊英 潘 玥 李 華 施海晶 趙玉嬌 孫強明 馬紹輝

腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)屬小RNA病毒科(picornaviridae)腸道病毒屬(enterovirus)，主要引起手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)、皰疹性咽峽炎、無菌性腦炎、無菌性腦膜炎和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹。近年來，EV71在我國廣泛流行。據(jù)中國CDC報道在2008年手足口病感染者為488955例，死亡126例;2009年1155525例，死亡為353例和2010年1795336例，死亡為888例。

EV71為單股正鏈RNA病毒，其病毒的毒粒為二十面體立體對稱，呈球形，直徑約為23～33nm，核衣殼裸露，無包膜和突起。其基因組只含1個大的開放讀碼框架(ORF)，該ORF依次分為P1、P2和P33個區(qū)，其中P1區(qū)編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP1到VP4，組成病毒衣殼，而P2和P3區(qū)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白。根據(jù)病毒衣殼蛋白VP1核苷酸序列的差異將EV71病毒分為3個基因型，即A、B、C型，B和C分別分為B1～B5和C1～C5亞型［1］。

為了解昆明地區(qū)流行的EV71基因型和流行特點，本研究對2009年昆明地區(qū)流行的EV71部分分離毒株進行全VP1(891bp)核苷酸序列擴增和測序，并與GenBank上的序列進行比對及分析，為預(yù)防和控制EV71流行提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1.材料:①細胞:VERO細胞皆由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所免疫室保存并提供;②標(biāo)本來源:34份糞便標(biāo)本標(biāo)本采集于疫情發(fā)生地區(qū)手足口病患者，－20℃保存;③RNA提取試劑盒:Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit.lot:KC50090501－B－G;④RT－PCR Kit:TAKARA One step RT－PCR Kit VER.2203.lot:BK1101。

2.方法:(1)病毒分離與鑒定:采用組織培養(yǎng)法，取糞便標(biāo)本1g，加入5m l0.01M PBS(pH7.4)制成懸液，3000r/min，離心30min，用0.45μl濾器除菌過濾，接種已長成致密單層的Vero細胞，細胞培養(yǎng)嚴(yán)格按WHO分離腸道病毒規(guī)程操作，于37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%小牛血清的MEM。觀察病毒在細胞上的細胞病變情況(CPE)，如果無CPE，盲傳3代;3代后無CPE出現(xiàn)，判為陰性。病毒繼續(xù)在Vero細胞培養(yǎng)增殖2代。(2)病毒的提取:按照Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit試劑盒說明書操作，具體步驟為:先取樣品200μl加入200μl V－L緩沖液，靜置5min后加75μl V－N緩沖液混勻，12000×g離心5min;然后，取上清與300μl異丙醇(1%冰乙酸)混勻，并將混合液移入制備管中，6000×g離心1min;分別用500μlW1和800μlW2緩沖液洗滌，12000×g離心1min，最后用50μl TE洗脫，并貯存在－70℃。(3)引物設(shè)計:引物參照參考文獻［2］，并根據(jù)FY23(EU812515)設(shè)計如下: EV713F:5'－TGTTYACTGGATCCTTCATGGC－3'(2070～2091);EV713R:5'－GCCAGCRTAATTTGGRTTGGCT－3' (3282～3261);EV714F:5'－TRCCATTCATGTCACCTGCGA－3'(3012～3032);EV714R:5'－TACGACACATTCCCAAACAT－3'(4320～4301)。(4)PT－PCR:采用TaKaRa公司生產(chǎn)的One－step RNA PCR kit(AMV)試劑盒。反應(yīng)條件:50℃30 min，反轉(zhuǎn)錄95℃2min后94℃50s，50℃50s，72℃1.5min，循環(huán)35次，72℃延伸7min，然后轉(zhuǎn)入4℃。取擴增產(chǎn)物5μl，用1.0%瓊脂糖電泳，根據(jù)Marker位置對擴增片段進行確認(rèn)。(5)序列測定和數(shù)據(jù)分析:擴增陽性的PCR產(chǎn)物由北京三博生物技術(shù)有限公司進行純化和序列測定。其他有關(guān)EV71的VP1序列從NCBI的基因數(shù)據(jù)庫(GenBank)上下載，通過Mega 4.1對測序結(jié)果進行處理和分析。參比序列如下:BrCr: AB204853;BrCr－TR:AB204852;J115－MAL－01: DQ341360;804－NO－03:DQ452074;1M－AUS－12－00: DQ341361;Tainan－4643－98:AF304458;Tainan－4746－98: AF304459;Tainan－5746－98:AF304457;03－KOR－00: DQ341356;06－KOR－00:DQ341355;Fuyang.Anhui.P.R.C－ 17.08－3:EU703813;F1－CHN－00:AB115490;SHZH98: AF302996;SHZH03:AY465356;1431－Yamagata－07: AB433881;1571－Yamagata－07:AB433883;AnHui－HeFei: EU697903;2007－07364:EU527983;NTU1482－TW－06: DQ846662;258－Bulgaria75:AB059814;Nagoga－Japan73: AB059813;7968－PA－87:AF009524;8102－WA－87: AF009526;NOH0037－SIN－08:FJ461788;SB11977－SAR－03:AY905549;17M－AUS－5－99:AF376094;MY1049－SAR－97:DQ341368;2120－SIN－01:AF376112;SB1647－SAR－00:AF376065。

結(jié)果

1.病毒分離及鑒定:將直接從臨床樣品中鑒定為EV71的34手足口病患者的糞便標(biāo)本，分別接種Vero細胞后，培養(yǎng)分離到6個陽性分離物，收集上清，并保存在－70℃。從中分離得到的陽性毒株為6株，經(jīng)微量中和試驗鑒定，均確認(rèn)為EV71病毒。

2.RT－PCR產(chǎn)物確定及測序:采用特異性引物做一步法RT－PCR，取5μl RT－PCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖膠電泳，大小與所設(shè)計一樣。將擴增出的特異性核酸片段測序，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)EV71的VP1序列同源達95%。并獲得基因登陸號:HQ199874、HQ199875、JF505389、JF505390、JF505391和JF505392。

3.基因型和系統(tǒng)進化分析:將EV71分離株完整VP1的核苷酸與GenBank中28株的VP1經(jīng)Mega4.1分析，發(fā)現(xiàn)此次暴發(fā)EV71與其他C基因型C1、C2、C3和C5的VP1的同源性為87.9%～89.1%，而與C4基因型的同源型為92.6%～98.5%，與SHZH98的同源性最低為92.6%，而本次6個分離株之間的同源性為95.4%～97.9%。與其他基因型的同源性為82.7%～84.6%。另外，從表1也可看出;本次分離株與C4基因型的EV71的距離較小，而與其他基因型較大。

表1 分離株與其他不同基因型分離株VP1核苷酸兩兩距離分析(distances＆Std.Err)

董曉楠等［3］根據(jù)分析結(jié)果并參考前人的研究，設(shè)定VP1區(qū)同源性高于85%的毒株為同一基因型，同源性高于91%的毒株為同一基因亞型;以及從基于VP1的親緣性系統(tǒng)發(fā)生樹(圖1)，可見昆明暴發(fā)流行EV71分離株與C4基因型聚為一簇，因此，可認(rèn)為該次昆明流行株EV71的基因型為C4。

圖1 昆明EV71病毒分離株VP1基因進化樹

4.氨基酸序列的比較:經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)(表2)此次昆明流行的EV71與其他C基因型C1、C2、C3和C5的VP1的氨基酸的同源性為98.3%～99.1%，而與C4基因型的同源型為97.0%～99.7%，與SHZH98的同源性最低為97.0%，而本次6個分離株之間同源性為97.3% ～99.7%。與其他基因型的同源性為96.0%～97.6%。

討論

在本研究中，通過對昆明地區(qū)的EV71 VP1基因分析發(fā)現(xiàn)，昆明分離株屬于C4亞型，未發(fā)現(xiàn)其他基因型的存在，同時也發(fā)現(xiàn)所有EV71各分離株序列以及與其他C4基因型之間存在差異，而且隨著時間的推移，EV71發(fā)生了一定程度的變異。

表2 KM 9－09分離株VP1基因核苷酸和氨基酸同源性比較

接種EV71疫苗是預(yù)防和控制EV71流行的主要手段之一。目前國內(nèi)已有3家開始實施臨床試驗，而疫苗的免疫原性好壞決定該疫苗是否成功的關(guān)鍵因素。Oberste等［4］研究表明，EV71的VP1與決定血清型的抗原決定因子密切相關(guān)，根據(jù)VP1區(qū)序列進行分型結(jié)果與中和試驗鑒定結(jié)果一致性較好，與血清型相關(guān)性較其他結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)高，VP1蛋白是主要的病毒中和決定因子，它直接決定病毒的抗原性。Foo等［5～7］基于EV7141株(5865/SIN/00009)的VP1合成的兩個肽SP55(163～177)和SP70(208～222)能夠誘導(dǎo)出抗EV71的中和抗體，而另一合成的SP2肽(145～159)能夠誘導(dǎo)出良好的T細胞增殖反應(yīng)和細胞因子。從EV71VP1氨基酸分析的結(jié)果來看，除SHZH98在220處由L變成F，以及258－Bulgaria75 (B1)，2120－SIN－01(B4)，7968－PA－87(B2)和17M－AUS－5－99(B3)株在氨基酸164位由D變?yōu)镋外，其余各株均一致。而且C基因型氨基酸同源性為97.3% ～99.3%，與其他基因型的同源性為96.0%～97.6%。這說明C基因型在VP1氨基酸上較保守，這與以前研究結(jié)論相一致［8］。

EV71作為RNA病毒，其核苷酸的替代突變率為1.35×10－2位點/年［9］。自1969年分離到第一株EV71以來，EV71已經(jīng)分為A，B，C 3個型，而且B和C兩型分別又分為B1～B5和C1～C5亞型。另外，目前資料已經(jīng)顯示［10］，中國臺灣及鄰近的韓國、日本、新加坡、馬來西亞均有多種基因型及亞型的流行，而且不同階段可出現(xiàn)不同的EV71基因型。而中國除2008年安徽省阜陽市報道出現(xiàn)A基因外［11］，其余均為C4基因型。因此，對EV71監(jiān)測有利于了解該病毒的變異，并對其傳播途徑、預(yù)防和控制具有重要的意義。

1 Tee KK，Lam TT，Chan YF，et al.Evolutionary genetics of human enterovirus 71:origin，population dynamics，natural selection，and seasonal periodicity of the VP1 gene［J］.JVirol，2010，84(7):3339－3350

2 周世力，李琳琳，何雅青，等.我國分離的腸道病毒71型(SHZH03病毒株)全基因組核苷酸序列分析［J］.病毒學(xué)報，2004，20(1):1－11

3 董曉楠，應(yīng)劍，陳應(yīng)華.1970～2004年全球腸道病毒71型分離株的分子流行病學(xué)分析［J］.科學(xué)通報，2007，52(9):1021－1027

4 Oberste MS，Maher K，Kilpatrick，DR，et al.Molecular evolution of the human enteroviruses:correlation of serotype with VP1 sequence and application to Picornavirus classification［J］.JVirol，1999，73: 1941－1948

5 Foo DG，Alonso S，Chow VT，et al.Passive protection against lethal enterovirus71 infection in newborn mice by neutralizing antibodies elicited by a synthetic peptide［J］.Microbes Infect，2007，9(11):1299－1306

6 Foo DG，Alonso S，Phoon MC，etal.dentification of neutralizing linear epitopes from the VP1 capsid protein of Enterovirus 71 using synthetic peptides［J］.Virus Res，2007，125(1):61－68

7 Foo DG，Macary PA，Alonso S，et al.dentification of human CD4 T－cell epitopes on the VP1 capsid protein of enterovirus71［J］.Viral Immunol，2008，21(2):215－224

8 Shao MA，Jian SL，Jing JW，etal.Genetic analysis of the VP1 region of Human enterovirus 71 strains isolated in Fuyang，China，during 2008［J］.Virologica Sinica，2009，24(3):162－170

9 Bible JM，Pantelidis P，Chan PK，et al.Genetic evolution of enterovirus 71:epidemiological and pathological implications［J］.Rev Med Virol，2007，17(6):371－379

10 Solomon T，Lewthwaite P，Perera D，et al.Virology，epidemiology，pathogenesis，and control of enterovirus 71［J］.Lancet Infect Dis，2010，10(11):778－790

11 Yu H，Chen W，Chang H，etal.Genetic analysis of the VP1 region of enterovirus 71 reveals the emergence of genotype A in central China in 2008［J］.Virus Genes，2010，41(1):1－4