瑪依拉 許黎黎 鮑琳琳 呂 琦 鄧 巍 李楓棣 占玲俊 朱 華 馬春梅 秦 川

2009年 4月始發(fā)于墨西哥和美國(guó)的流感,是由一種新型的A(H 1N 1)甲型流感病毒引起的急性熱性呼吸道傳染病,短短數(shù)月,疫情蔓延全球?；蚍治霭l(fā)現(xiàn),新型A(H 1N 1)甲型流感病毒中 6個(gè)基因片段來(lái)源于豬流感病毒的“三源重配株”,2個(gè)基因片段來(lái)源于歐亞豬流感病毒[1]。甲型 H 1N 1流感大多數(shù)臨床表現(xiàn)為上呼吸道疾病,少數(shù)繼發(fā)嚴(yán)重肺炎、急性呼吸窘迫綜合征,個(gè)別的突發(fā)死亡病例,是由于機(jī)體缺乏對(duì)流感病毒的免疫力[2]。1918年西班牙流感和1968年香港流感,第 2波的發(fā)病比第 1波發(fā)病嚴(yán)重,出現(xiàn)此現(xiàn)象的一種可能的解釋是流感病毒適應(yīng)了宿主,導(dǎo)致出現(xiàn)強(qiáng)毒力,這種適應(yīng)性發(fā)生的原因是流感病毒間的基因重組或突變[3]。流感病毒的毒力,致病性,宿主范圍由多種因素決定,其中決定宿主特異性的主要原因包括糖蛋白 HA和NA與宿主表面唾液酸受體的親和力[4]。PA、PB1、PB2 3種聚合酶蛋白關(guān)鍵位點(diǎn)的變異在 H5N 1和 H 7N7及 1918年H 1N 1流行中占有重要地位[5]。非結(jié)構(gòu)蛋白 PB1-F2和NS1的多態(tài)性在H5N 1和1918年H1N 1暴發(fā)中也發(fā)揮一定作用[6]。序列分析顯示 2009年新型 A (H 1N 1)甲型流感病毒缺少在禽類和哺乳動(dòng)物中強(qiáng)致病性因素,如 HA裂解位點(diǎn)處的多個(gè)堿性氨基酸, PB2聚合酶蛋白第 627位賴氨酸等[7,8]。A(H1N 1)甲型流感病毒的毒力機(jī)制是由多因子決定的,仍需深入研究。

本實(shí)驗(yàn)選擇 3種毒株,研究 2009年 A(H1N 1)甲型流感病毒基因序列多態(tài)性對(duì)病毒復(fù)制及毒力的影響。病毒復(fù)制分析在MDCK細(xì)胞中進(jìn)行,毒力和致病性實(shí)驗(yàn)在BALB/c小鼠體內(nèi)進(jìn)行。我們希望本研究能進(jìn)一步了解 2009年A(H 1N 1)甲型流感病毒基因多態(tài)性在病毒復(fù)制,毒力,致病性和分子演變中的重要作用。

材料與方法

1.病毒株:3種毒株的背景信息,A/California/04/2009為世界范圍內(nèi)首例A(H 1N 1)甲型流感病毒分離株,A/Sichuan/ 1/2009從中國(guó)第 1例甲型流感病毒感染病人身上分離而來(lái),此病人系 2009年 5月從美國(guó)回國(guó)。A/Beijing/3/2009感染患者有輕微癥狀。3種毒株分別在MDCK細(xì)胞中傳代培養(yǎng),根據(jù) Reed-M uench方法計(jì)算病毒的 TC ID50[9]。體外細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)都按照世界衛(wèi)生組織指導(dǎo)原則在BSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

2.方法:(1)病毒感染細(xì)胞:MDCK細(xì)胞在含有 10%胎牛血清的DM EM(Invitrogen公司)中培養(yǎng),102TC ID50病毒液接種于單層培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的 35mm培養(yǎng)板上,37℃吸附 60m in,加入 3m l無(wú)血清培養(yǎng)基,含 TPCK胰蛋白酶 (0.5μg/m l)(Sigm a公司)和抗生素 (Sigm a公司)。分別在感染細(xì)胞后 0,12, 24,36,48,56,72,96h收集 100μl病毒上清液,3000 r/m in離心10m in。(2)病毒感染小鼠:實(shí)驗(yàn)在本所的BSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。SPF級(jí) 5周齡雌性BALB/c小鼠(由醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供),每組 23只,分為組 1(10只)及組 2(13只)將小鼠按0.02m l/g比例肌內(nèi)注射三溴乙醇麻醉后,通過(guò)滴鼻途徑接種小鼠,3種毒株病毒液稀釋為 106TC ID50,每只小鼠的接種劑量為 50μl。組 1小鼠連續(xù)觀察 14天記錄臨床表現(xiàn)和病死率。組 2小鼠在攻毒后第 5天安樂(lè)后取肺組織,其中 10份進(jìn)行核酸定量和病理學(xué)檢察,另 3份進(jìn)行病毒效價(jià)的檢測(cè)。(3)Real -tim e PCR:小鼠肺組織研磨成勻漿,從上清液中提取 RNA (Q iagen公司),溶于 30μlDEPC水中,保存于 -80℃。取 8μl RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 cDNA的合成,加入到總體積為 20μl,含有200U Superscrip tⅢ反轉(zhuǎn)錄酶 (Invitrogen公司)的反應(yīng)體系中。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)體系為 20μl,包括 10μl 2×SYBR Green熒光染料M ix(AB I公司),各 1μl 10μmo l/L的正向和反向引物(SW-HA F786:5′-AATAACATTAGAAGCAACTGG-3′,SW-HAR920:5′-AGGCTGGTGTTTATRGCACC-3′),2μl cDNA模板和 6μl無(wú) RNA酶的水。熱循環(huán)條件,94℃ 3m in,94℃30s,58℃30s,72℃30s,35個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)結(jié)束后讀取熒光值。(4)血凝實(shí)驗(yàn):MDCK細(xì)胞感染病毒后,上清液中的病毒效價(jià)用 1%火雞血細(xì)胞作為指示劑進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。50μl病毒液與 1%火雞紅細(xì)胞懸液等體積混合,室溫靜置 30m in。血凝效價(jià)的判定以出現(xiàn)凝集的最高稀釋度為終點(diǎn),其稀釋度的倒數(shù)即為病毒的血凝效價(jià)。(5)病理學(xué)檢查:迅速取出安樂(lè)死后小鼠的肺組織,10%甲醛固定 4℃,過(guò)夜。石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色,光鏡下觀察病理變化 (OLYMPUSBX-50,放大倍數(shù) 40)。(6)基因測(cè)序與比對(duì)分析:3種病毒的基因片段利用高保真 PCR擴(kuò)增(KOD p lus),擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測(cè)序。利用 CLUSTALW(version 1.83)軟件對(duì) 3種毒株的基因序列進(jìn)行比對(duì)。(7)數(shù)據(jù)分析:病毒載量和效價(jià)的數(shù)據(jù)處理運(yùn)用 SPSS 11.5軟件單因素方差分析法。

結(jié) 果

1.細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制力比較:在病毒感染MDCK細(xì)胞 48h后 A/Sichuan/1/2009病毒株的病毒 RNA載量顯著高于其他兩株 (P<0.05),而 A/California/ 04/2009和 A/Beijing/3/2009兩種毒株的病毒 RNA載量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖 1)。

圖1 細(xì)胞中病毒RNA載量

2.小鼠體內(nèi)病毒毒力比較:為進(jìn)一步體內(nèi)比較 3種病毒株的毒力,我們選擇BALB/c小鼠作為動(dòng)物模型,通過(guò)鼻內(nèi)接種病毒液,觀察發(fā)病情況,病死率,及肺組織測(cè)定病毒 RNA載量和效價(jià),80%的小鼠在接種 A/Sichuan/1/2009病毒后死亡,A/California/04/ 2009毒株感染后的存活率是 60%,A/Beijing/3/2009病毒株感染后沒(méi)有出現(xiàn)死亡小鼠 (圖 2)。A/Sichuan/1/2009株感染后,小鼠的平均存活天數(shù)是 6.8天,是 3種毒株中最低組(圖 3)。

為進(jìn)一步比較 3種毒株的毒力及致病性,我們檢測(cè)了攻毒后小鼠肺組織的載毒情況,主要指標(biāo)是檢測(cè)感染后 5天,當(dāng)病毒擴(kuò)散達(dá)高峰時(shí)的病毒 RNA載量和病毒效價(jià)。接種 A/Sichuan/1/2009株病毒液的小鼠肺組織病毒 RNA載量顯著高于其他兩種毒株 (P< 0.05),病毒效價(jià)較其他兩種毒株高(圖 4、圖 5)。

而且,通過(guò)切片、HE染色鏡下觀察接種病毒后 5天小鼠的肺組織病理變化,3種毒株感染小鼠的肺組織均有充血、出血、水腫、滲出等炎癥病理變化。接種A/Sichuan/1/2009病毒株的小鼠,100%肺組織出現(xiàn)病變,接種 A/Califo rnia/04/2009病毒株的小鼠85%肺組織出現(xiàn)病變,接種 A/Beijing/3/2009病毒株的小鼠肺組織出現(xiàn)病變的發(fā)生率是 60%(圖 6、圖7)。

圖 6 小鼠肺臟 HE病理組織切片(×40)

圖 7 感染小鼠肺組織病變范圍

3.病毒基因組序列分析:通過(guò)高保真 PCR獲得3種毒株的全基因組片段并測(cè)序,與其他兩種毒株相比 A/Sichuan/1/2009株 HA蛋白 32位點(diǎn)處,亮氨酸突變?yōu)楫惲涟彼帷Ｍ瑫r(shí),PA蛋白 343位點(diǎn)處丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸,PB1蛋白 353位點(diǎn)和 566位點(diǎn)處分別是賴氨酸突變?yōu)榫彼?蘇氨酸突變?yōu)楸彼?PB2蛋白 471位點(diǎn)處蘇氨酸突變?yōu)榧琢虬彼帷?/p>

討 論

抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變引起流感病毒的暴發(fā)和流行。2009年新型A(H1N 1)甲型流感病毒引起較溫和的疾病和相對(duì)低的致死率,但是也出現(xiàn)個(gè)別嚴(yán)重的致死病例。病毒基因組中關(guān)鍵區(qū)域的突變是引起流感病毒株毒力增強(qiáng)及導(dǎo)致大流行的主要原因之一[10]。在本研究中,體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明全基因組序列的多態(tài)性是決定 2009年A(H1N 1)甲型流感病毒復(fù)制能力,毒力,及致病性的關(guān)鍵因素。

在感染 MDCK細(xì)胞 48h后,A/Sichuan/1/2009株相較另外兩株顯示了顯著性增強(qiáng)的復(fù)制能力,血凝實(shí)驗(yàn)顯示 A/Sichuan/1/2009株呈現(xiàn)最高的病毒效價(jià)。在BALB/c小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,A/Sichuan/1/2009株感染的小鼠存活率最低,存活天數(shù)最短,肺組織中RNA的載量及病毒效價(jià)最高,肺組織出現(xiàn)最嚴(yán)重的病理改變。實(shí)驗(yàn)證實(shí)在體外MDCK細(xì)胞中和BALB/ c小鼠體內(nèi) A/Sichuan/1/2009株均具有最強(qiáng)的復(fù)制能力及致病性。

基因序列分析發(fā)現(xiàn) A/Sichuan/1個(gè)/2009株有 5個(gè)特異突變位點(diǎn)。HA蛋白中 32位點(diǎn)L突變?yōu)?I,PA蛋白中 343位點(diǎn)的A突變?yōu)?T,PB1蛋白中 353位點(diǎn)的 K突變?yōu)?R,566位點(diǎn)的 T突變?yōu)?A,PB2蛋白中471位點(diǎn)的 T突變?yōu)镸。結(jié)構(gòu)分析顯示 32位的氨基酸并沒(méi)有參與 HA蛋白的受體結(jié)合和細(xì)胞膜融合過(guò)程,所以 HA蛋白中 32位點(diǎn)亮氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岵皇嵌玖υ鰪?qiáng)的決定因素[11]。聚合酶基因與病毒的毒力密切相關(guān)。PA蛋白第 515位點(diǎn)的突變?cè)?H 5N 1流感的暴發(fā)流行中起關(guān)鍵作用[12]。反向遺傳學(xué)研究顯示 PB2基因中 627位點(diǎn) E突變?yōu)?K和 701位點(diǎn)D突變?yōu)镹對(duì)流感病毒在哺乳動(dòng)物中的適應(yīng)性增強(qiáng)有重要作用[8]。PB2基因中第 701氨基酸位點(diǎn)在鴨源H 5N 1流感復(fù)制中起重要作用,其突變會(huì)導(dǎo)致小鼠的致死效應(yīng)[13]。同樣,PB 2氨基酸殘基的變異會(huì)增加H 7N 1鳥(niǎo)源流感在小鼠模型中的致死率[14]。最近的研究顯示,PB2蛋白第 271位點(diǎn) T突變?yōu)?A,會(huì)提高聚合酶的酶活從而使病毒在人體內(nèi)更快的復(fù)制[15]。有研究報(bào)道,由 PB 1基因閱讀框移碼翻譯編碼的約90個(gè)氨基酸的 PB1-F2,在毒力增強(qiáng)過(guò)程中起重要作用,在小鼠模型中 PB 1-F2蛋白第 66位點(diǎn)的絲氨酸和高致病性有關(guān)。以上資料顯示聚合酶復(fù)合體與病毒的高毒力及致病性密切相關(guān),A/Sichuan/1/2009株聚合酶復(fù)合體中 4個(gè)殘基的突變?cè)?2009年新型A (H 1N 1)甲型流感病毒毒力中起重要作用。然而,究竟是聚合酶復(fù)合體中 1個(gè),2個(gè)或者是 4個(gè)氨基酸的同時(shí)替換,才導(dǎo)致最終毒力的增強(qiáng),還需要進(jìn)一步的反向遺傳學(xué)及單突變感染實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

綜上所述,我們發(fā)現(xiàn) 2009年新型 A(H 1N 1)甲型流感病毒基因多態(tài)性對(duì)其在MDCK細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力和BALB/c小鼠模型體內(nèi)的毒力及致病性中起重要作用。PA蛋白中 343位點(diǎn)的 A突變?yōu)?T, PB 1基因中 353位點(diǎn)的 K突變?yōu)?R,566位點(diǎn)的 T突變?yōu)锳,PB 2基因中 471位點(diǎn)的 T突變?yōu)镸,這些位點(diǎn)的突變與病毒毒力的增強(qiáng)密切相關(guān)?；蚪M內(nèi)關(guān)鍵位點(diǎn)的變異對(duì) 2009年新型 A(H 1N 1)甲型流感病毒的復(fù)制、毒力致病性的影響尚需進(jìn)一步研究。

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