固相萃取-超高效液相色譜-質譜/質譜法測定動物源性食品中二硝甲酚殘留量

吳 巖，康慶賀，劉 永，胡 珅，楊長志，高凱洋

(1.黑龍江出入境檢驗檢疫局，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江大學化學化工與材料學院，黑龍江 哈爾濱 150086；3.東寧出入境檢驗檢疫局，黑龍江 東寧 157200)

固相萃取-超高效液相色譜-質譜/質譜法測定動物源性食品中二硝甲酚殘留量

吳 巖1,2，康慶賀1,*，劉 永1，胡 珅3，楊長志1，高凱洋2

(1.黑龍江出入境檢驗檢疫局，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江大學化學化工與材料學院，黑龍江 哈爾濱 150086；3.東寧出入境檢驗檢疫局，黑龍江 東寧 157200)

建立動物源性食品中二硝甲酚殘留量的分析方法。樣品以丙酮-正己烷(1∶2，V/V)為提取溶劑，經高速勻漿方法提取，提取液經Oasis HLB固相萃取柱凈化，除去樣品中大部分的脂肪和無機鹽等干擾基質，有效地降低了樣品中的復雜基質所帶來的背景干擾。以乙腈-水(梯度洗脫)為流動相經BEH C18柱(50mm×2.1mm，1.7μm)進行分離后以MS/MS多反應監(jiān)測掃描模式下檢測。方法的相關系數r＞0.999，最低檢出限為0.005mg/kg。在3種添加水平(0.005、0.010、0.020mg/kg)條件下，其平均回收率為82.6%～108%，相對標準偏差小于10%(n＝6)。該方法是一種快速、準確、靈敏度高的檢測動物源性食品中二硝甲酚殘留量的檢測方法。

固相萃??；超高效液相色譜-質譜/質譜；二硝甲酚；動物源性食品；除草劑

二硝甲酚，化學名稱為4,6-二硝基鄰甲酚(dinitro-O-cresol，DNOC)是屬于除草劑，常用在春天或冬天耕作時期防除闊葉雜草，同時，由于其具有胃毒和觸殺作用，也可做殺蟲劑使用[1]。這種農藥藥效高、易分解，在農藥品種中占有極為重要的位置。醫(yī)學研究表明，二硝甲酚對小鼠的半數致死量LD50為21mg/kg，對人、畜的急性毒性很強，其廣泛應用可能對人類造成潛在的健康威脅和生態(tài)環(huán)境的污染。

目前，美國、歐盟和日本等許多發(fā)達國家對二硝甲酚的殘留提出嚴格的限量要求，尤其是日本推行的肯定列表制度，規(guī)定其最大殘留限量為0.01mg/kg，而目前我國分析動物源性食品中二硝甲酚殘留量的方法不多，已有的行業(yè)標準檢測方法采用將樣品中的二硝甲酚與重氮甲烷進行衍生化后經氣相色譜-氮磷檢測器(GCNPD)測定[2-3]，該方法存在用時長、消耗試劑較多、重氮甲烷制備過程繁瑣、衍生化條件需控制嚴格、衍生化效率不穩(wěn)定、假陽性結果不能準確判斷、檢測低限(0.02mg/kg)不能滿足實際需要需要等實際問題。因此，本實驗建立了一種以Oasis HLB固相萃取柱進行凈化，采用超高效液相色譜-質譜/質譜法(UPLC-MS/MS)測定動物源性食品中二硝甲酚殘留的檢測方法，該方法具有操作方便、分析速度快、靈敏度高、選擇性強、定性準確等優(yōu)點，對于彌補該農藥檢測方法的不足、解決國外貿易技術壁壘、推動食品安全又快又好的發(fā)展具有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取豬肉、雞肉、牛肉及其臟器代表性樣品約500g，將其可食部分切碎后，用組織搗碎機將充分搗碎均勻，裝入潔凈容器作為試樣，密封并標明標記，于-18℃以下保存。

丙酮、正己烷、甲醇和乙腈均為色譜純試劑；無水硫酸鈉(分析純，650℃灼燒4h，貯于密封干燥器中備用)；氯化鈉(分析純，200℃烘干2h)。二硝甲酚標準品(純度大于98%) 德國DR公司。

ENVI Alumina-N固相萃取柱[1000mg(6mL)]、ENVI Florisil固相萃取柱[1000mg(6mL)] 美國Supelco公司；Oasis HLB固相萃取柱[60mg(3mL)] 美國Waters公司。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜-質譜/質譜儀 美國Waters公司；高速勻漿機、旋轉蒸發(fā)器 德國IKA公司；氮吹儀；高速離心機；固相萃取裝置 美國Supelco公司。

1.3 液相色譜-質譜條件

色譜柱：BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)；流動相A為乙腈，B為水；梯度洗脫：0～0.5min，15% A；0.5～1.0min，15%～60% A；1.0～2.0min，60% A；2.0～2.5min，60%～15% A；2.5～3.0min，15% A。流速0.25mL/min；柱溫30℃；進樣量5μL。

電噴霧離子源：負離子模式；毛細管電壓：3.0KV；錐孔電壓：40V；離子源溫度：110℃；脫溶劑器溫度：350℃；脫溶劑氣流量：500L/h；錐孔氣流量：50L/h。掃描方式：多反應離子監(jiān)測模式。

1.4 標準溶液的配制

準確稱取適量的二硝甲酚農藥標準品，用乙腈配制成100.0mg/L的標準儲備液；根據需要再用水逐級稀釋成質量濃度為0.005、0.01、0.05、0.2mg/L和0.5mg/L的系列混合標準工作溶液。

1.5 樣品前處理

稱取5g絞碎均勻的樣品于50mL的聚丙烯離心管中，加入10mL水、4g氯化鈉，再加入20mL丙酮-正己烷(1∶2，V/V)，用勻漿機高速均質2min，然后在3500r/min離心5min；將上清液通過無水硫酸鈉柱脫水于100mL濃縮瓶中。再用20mL正己烷-丙酮重復提取一次，合并提取液于同一100mL濃縮瓶中，在35℃水浴中用旋轉蒸發(fā)器濃縮至近干，再用氮氣流吹干。向濃縮瓶中加入3mL 20%甲醇溶液溶解殘渣待凈化。

將Oasis HLB固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL水進行預淋洗，然后將提取液上樣，上樣后依次用3mL水、3mL 20%甲醇淋洗凈化柱，控制流速在1～2mL/min，棄去淋洗液，然后用2mL甲醇洗脫目標化合物，收集洗脫液與15mL的刻度試管中，在40℃條件下氮氣吹至近干，用流動相定容至5mL，待測。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

為了優(yōu)化二硝甲酚的分離條件，本方法分別對BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)柱與BEH Phenyl(苯基) (50mm×2.1mm，1.7μm)柱的分離效果進行了比較(圖1)，可以看出，在使用相同流動相時，C18柱的分離效果要遠遠好于Phenyl柱，由于二硝甲酚的極性較強，反相保留原理的C18柱更適于分離目標化合物。

對于流動相種類的優(yōu)化，本方法對以乙腈-水體系和甲醇-水進行了比較，兩者在分離度靈敏度方面的響應程度差別不大，考慮到乙腈的溶解性較好，本方法還是選用乙腈-水體系作為流動相對二硝甲酚進行分離測定。

從圖1可以看出，二硝甲酚的保留時間為1.67min，在保證較高柱效、較高分離度的前提下，采用本方法較已有的氣相色譜法在很大程度上提高了分析的速度與效率，節(jié)約了分析時間與分析成本。

圖1 不同色譜柱分離二硝甲酚的色譜圖Fig.1 Separation profile of DONC on different chromatographic columns

2.2 提取溶劑的選擇

由于二硝甲酚屬于屬于極性較強的化合物，在選取提取溶劑時也應遵循“相似相容”原理，本方法對乙腈、丙酮、乙酸乙酯、丙酮-正己烷(1∶2，V/V)等提取溶劑的提取效率進行了比較[4]。通過實驗可知，在采用乙腈、丙酮作為提取溶劑時，均質的過程中能夠和容易的將基質均質完全，但是，提取液中含有一定量的水，在濃縮的過程中即使在較低溫度(不高于35℃)時也會出現暴沸現象，并且隨著溶劑的蒸發(fā)減少，濃縮瓶內出現大量的表面張力較大的泡沫，隨時可能倒吸進入蒸發(fā)腔內，不僅污染濃縮系統，而且造成目標化合物的損失，蒸發(fā)效率不高，無法進行下一步的凈化；當采用乙酸乙酯、丙酮-正己烷(1∶2，V/V)作為提取溶劑時，提取液在濃縮時較為容易，但是就提取效率而言，由于乙酸乙酯極性相對丙酮-正己烷(1∶2，V/V)較弱，后者的提取效率更高，作為二硝甲酚的提取溶劑效果更好。

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

由于動物源性樣品基質(動物肉及動物腎臟等)中的脂肪和提取液中的無機鹽類是產生的基質效應的主要因素，因此本方法選取能夠除去這兩種干擾物質的ENVI Alumina-N、ENVI Florisil和Oasis HLB固相萃取柱的凈化效果進行優(yōu)化比較[5]。

采用ENVI Alumina-N和ENVI Florisil凈化時，二者屬正相固相萃取柱，在使用前依次用3mL丙酮、5mL正己烷預活化，提取液經濃縮后用正己烷定容至3mL上樣，由于二硝甲酚的化學結構上帶有兩個硝基基團，具有較強的電負性，理論上能夠在非極性溶劑(使用正己烷作為上樣溶劑)上樣時被固定相吸附，在極性溶劑條件下[采用丙酮-正己烷(1∶9，V/V)作為洗脫溶劑]能夠被解吸，但是實驗表明，在作淋洗曲線時，上樣和洗脫的過程中都有二硝甲酚流出，并且，當洗脫液的體積達到20mL時還沒有將其完全洗脫下來，不符合正相色譜的吸附解吸理論，得不到很好的凈化脂肪的效果。

當采用Oasis HLB固相萃取柱時，依次采用3mL甲醇、3mL水進行活化后，將待測溶液以20%甲醇溶液上樣，二硝甲酚能夠完全被吸附保留在固定相上，然后用3mL水淋洗該柱，除去基質中的水溶性化合物和無機鹽類等干擾物質，再用3mL 20%的甲醇溶液淋洗除去極性較強的小分子有機酸類干擾物質，最后用2mL甲醇洗脫目標化合物，通過以上淋洗步驟，能夠較好地降低樣品基質效應所帶來的干擾，得到滿意的凈化效果(圖2)，對提高儀器的靈敏度有明顯的作用。

圖2 豬肉樣品經Oasis HLB固相萃取柱凈化后的色譜圖Fig.2 Chromatogram of pork sample cleaned up on Oasis HLB solid-phase extraction column

2.4 MS/MS特征離子對的選擇

由于二硝甲酚在苯環(huán)結構上的4位和6位上含有電負性的硝基基團，故在優(yōu)化質譜條件時選擇負源進行電離[6]，本方法采用乙腈-水為流動相，結合基質空白和基質標液的離子掃描圖進行了優(yōu)化，通過優(yōu)化毛細管電壓與碰撞能量，找到以M-H為母離子的4組特征離子對分別為m/z 196.68＞179.74、196.68＞166.69、196.68＞136.81、196.68＞108.53，其裂解碎片圖見圖3。

表1 二硝甲酚的質譜分析優(yōu)化參數Table 1 Optimal parameters for the MS/MS analysis of DNOC residue in the MRM mode

圖3 二硝甲酚的裂解原理圖Fig.3 Fragmentation principle of DNOC

由裂解碎片的結構可以看出，m/z 196.68＞136.81與m/z 196.68＞108.53這兩組特征離子對的結構穩(wěn)定，從而確定了二硝甲酚在多反應監(jiān)測模式下信號的特征離子對的最佳條件參數(表1)。

2.5 標準曲線和最低檢出限

配制二硝甲酚的質量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.2、0.5mg/L的標準溶液，進行然后進行UPLC-MS/MS分析。測定時，根據其標準物質和待測樣品的MRM離子流圖中的峰面積，外標法定量。以農藥的選擇離子的峰面積(A)對農藥的質量濃度C/(mg/L)繪制標準曲線，并求得直線回歸方程A＝2305.2C＋20.1，在0.005～0.5mg/L內的線性關系良好，且相關系數r＞0.999，方法的最低檢出限為0.005mg/kg，能夠滿足殘留檢測的要求。

2.6 方法的回收率及精密度

表2 動物源性食品(雞肉、豬肉、雞肝)中二硝甲酚添加回收實驗結果Table 2 Recovery rates of DNOC in spiked chicken meat, pork and chicken liver

本方法采用標準加入法，選取已粉碎均勻雞肉、豬肉、雞肝作為代表性樣品分別進行添加回收實驗[7-21]。準確稱取5.00g樣品分別按照3個添加水平(0.005、0.01、0.02mg/kg)添加二硝甲酚標準品，每個濃度平行測定6次，按上述方法提取凈化樣品，并進行UPLC-MS/MS分析，計算平均回收率和精密度，結果得到所有農藥的回收率均在82.6%～108%之間，精密度也均小于10%，具體實驗結果見表2。

3 結 論

本研究建立的UPLC-MS/MS方法，樣品前處理提取效率高、固相萃取的凈化效果較好、條件易于控制，并且采用超高效液相色譜-質譜/質譜分析，分析速度快、選擇性好、靈敏度高，極大的縮短了檢測時間，結果準確可靠。本方法的回收率、精密度和檢出限優(yōu)于文獻報道值和原有的行業(yè)標準。本方法的定量限低于日本肯定列表所規(guī)定的最高殘留限量，可以用于動物源性食品中二硝甲酚殘留量的檢測。

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Determination of 4,6-Dinitro-O-Cresol (DNOC) Residue in Animal-origin Foods by Solid-phase Extraction and Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WU Yan1,2，KANG Qing-he1,*，LIU Yong1，HU Shen3，YANG Chang-zhi1，GAO Kai-yang2
(1. Heilongjiang Entry-Exit Inspection and Quaratine Bureau, Harbin 150001, China；2. School of Chemistry and Materials Science, Heilongjiang University, Harbin 150086, China；3. Dongning Entry-Exit Inspection and Quaratine Bureau, Dongning 157200, China)

A solid-phase extraction and ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method has been developed for the determination of DNOC residue in animal-origin foods. Samples were extracted with acetone-hexane (1∶2, V/V) after high-speed homogenization. The crude extract was purified on Oasis HLB solid phase extraction column to remove fat and inorganic salts, which could effectively reduce the background interference generated by complex matrix in samples. The DNOC residue was separated on BEH C18 (50 mm × 2.1 mm, 1.7μm) column using acetonitrile-water as the mobile phase by gradient elution and detected using a tandem mass analyzer in the multi-reaction monitoring (MRM) mode. The developed method exhibited an excellent linear relationship (r＞0.999) and a detection limit of 0.005 mg/kg. At the spiked levels of 0.005, 0.01 mg/kg and 0.02 mg/kg, the average recovery rates for DNOC were in the range of 82.6%-108% with a relative standard deviation (RSD) of less than 10% (n = 6). This method proved rapid, accurate and highly sensitive and can therefore be used for the determination of DNOC residue in animal-origin foods.

solid-phase extraction (SPE)；ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLCMS/MS)；DNOC；animal-origin food；herbicide

TS207.5

A

1002-6630(2011)14-0268-05

2010-10-10

國家質檢總局行標修訂任務項目(2009B803r)

吳巖(1981—)，男，工程師，碩士，研究方向為食品安全檢測技術。E-mail：nkwuyan@163.com

*通信作者：康慶賀(1959—)，男，研究員，學士，研究方向為食品安全檢測技術。E-mail：mkangqh@126.com