厚樸中厚樸酚及和厚樸酚提取工藝的優(yōu)化研究

李 銳，陳中蘭，肖 宏，林世和，曾慶源

（1.湖北省鐘祥市人民醫(yī)院，湖北 荊門 431900； 2.湖北省武漢市第一醫(yī)院，湖北 武漢 430000；3.湖北省武漢市第三醫(yī)院，湖北 武漢 430000）

厚蘭荷貼劑為鐘祥市人民醫(yī)院經(jīng)驗(yàn)方，主要由厚樸[1－2]、板藍(lán)根、薄荷等藥材組方，對(duì)口腔潰瘍、牙周炎癥等口腔疾病有良好的治療效果。方中主藥厚樸有較強(qiáng)的抗菌作用，其中所含厚樸酚、和厚樸酚是主要的抗菌成分[3－8]。為此，以厚樸酚、和厚樸酚的提取率為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)厚樸醇提工藝進(jìn)行優(yōu)選，為生產(chǎn)工藝參數(shù)的確定提供數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與試藥

中藥材粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；98－1－B型電子調(diào)溫電熱套（上海亞榮生化儀器廠）；Starsorius BSI型電子分析天平（d=0.01 mg，北京賽多利斯天平有限公司）；Dionex－Ulimate 3000型半制備高效液相色譜儀；紫外檢測(cè)器。厚樸（批號(hào)為080511）購(gòu)于湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司，經(jīng)湖北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥鑒定教研室陳科力教授鑒定為木蘭科植物厚樸 Magnolia offisenalis Rehd.etWils的干燥干皮；厚樸酚對(duì)照品（批號(hào)為110729－200310）及和厚樸酚對(duì)照品（批號(hào)為110730－200609）由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；乙醇為化學(xué)純，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 厚樸提取物制備

分別精密稱取厚樸飲片9份，每份100 g，按正交設(shè)計(jì)表安排的因素和水平進(jìn)行加熱回流提取，提取液過濾，濾液減壓濃縮至相對(duì)密度1.10，加2％NaOH溶液調(diào)pH約為11，靜置2h，過濾，濾液再加2％的鹽酸溶液調(diào)pH約為2，靜置24h，過濾，沉淀水洗至中性，50℃真空干燥，制得厚樸提取物。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Dionex－Acclaim.120 C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇－水（75∶25）；柱溫：30℃；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：294 nm；進(jìn)樣量：10μL。色譜圖見圖1。

2.2.2 溶液制備

取厚樸提取物約0.1 g，精密稱定，置10mL容量瓶中，加甲醇10mL溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密稱取厚樸酚對(duì)照品20.5mg、和厚樸酚對(duì)照品12.5mg，精密稱定，加甲醇50mL，分別制成每1mL含厚樸酚410μg、和厚樸酚250μg的混合溶液，即得對(duì)照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.2.3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：分別精密吸取厚樸酚與和厚樸酚對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL，分別置10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述稀釋液10μL，注入液相色譜儀，按擬訂的色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，厚樸酚為 A=6772C+5 361（r=0.999 8），和厚樸酚為 A=11 648×105C－331 291 456（r=0.999 5）。結(jié)果表明，厚樸酚與和厚樸酚進(jìn)樣量分別在0.205～4.1μg和0.125～2.5μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：分別取厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品溶液各10μL，依法連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定峰面積。結(jié)果厚樸酚與和厚樸酚的 RSD分別為0.79％和0.62％（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，24，48h時(shí)測(cè)定峰面積。結(jié)果厚樸酚、和厚樸酚的 RSD分別為0.91％和1.13％（n=8），表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)為090311）6份，每份0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果樣品中厚樸酚、和厚樸酚平均含量分別為5.822mg/g和5.189mg/g，RSD分別為1.60％和1.58％（n=6），表明方法重現(xiàn)性好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為090311）0.25 g共6份，分別精密加入對(duì)照品溶液適量，依法測(cè)定并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 厚樸酚與和厚樸酚加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

精密吸取供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂的色譜條件測(cè)定峰面積，根據(jù)回歸方程求得厚樸酚與和厚樸酚的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

2.3 提取工藝優(yōu)選

2.3.1 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。選取料液比（因素A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（因素B）、提取時(shí)間（因素C）、提取次數(shù)（因素D）作為考察因素，各因素取3個(gè)水平，以L9（34）正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)，以厚樸酚與和厚樸酚得率之和為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)評(píng)分結(jié)果作直觀分析和方差分析，篩選最佳工藝條件。結(jié)果見表3－5。由方差分析結(jié)果可知，提取效果的影響因素大小順序?yàn)橐毫媳龋咎崛r(shí)間＞提取次數(shù)＞乙醇體積分?jǐn)?shù)，液料比、提取時(shí)間對(duì)結(jié)果影響顯著，提取次數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)則影響不顯著。根據(jù)直觀分析，最佳提取條件為A2B2C3D3，但由于因素C和因素D第2水平、3水平結(jié)果差異很小，為節(jié)約工時(shí)并考慮到工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際，決定選取第2水平。因此，優(yōu)選的提取工藝為A2B2C2D2，即料液比為8，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70％，提取3次，每次提取時(shí)間為2h。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表

表4 厚樸提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果表

表5 方差分析結(jié)果表

2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

為確定該工藝的優(yōu)劣和穩(wěn)定性，據(jù)優(yōu)選的提取工藝，對(duì)同一批藥材（取樣量為100 g）進(jìn)行3次試驗(yàn)。結(jié)果編號(hào)為071101，071102，071103的樣品提取物中厚樸酚與和厚樸酚的總得率分別為2.75％，2.68％，2.78％，平均2.74％，RSD=1.88％（n=3）。可見，該提取工藝厚樸酚與和厚樸酚總得率高、重現(xiàn)性好、工藝穩(wěn)定可行、實(shí)際操作簡(jiǎn)單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

3 討論

厚樸的主要抗菌有效成分為厚樸酚、和厚樸酚，因此正交試驗(yàn)選取厚樸酚與和厚樸酚總得率為考察指標(biāo)。關(guān)于厚樸中厚樸酚及和厚樸酚的含量測(cè)定方法很多，本研究采用的高效液相色譜法測(cè)定正交工藝提取制備的樣品，具有較好的靈敏度和準(zhǔn)確度。

厚樸中厚樸酚及和厚樸酚的提取工藝有冷浸法、煎煮法、超聲法等，但本研究選用的乙醇提取法較以上提取法提取的提取液抑菌效果更佳，且所需設(shè)備簡(jiǎn)單、工藝穩(wěn)定、提取效率較高、乙醇低毒、易回收、無污染。

本研究通過正交設(shè)計(jì)對(duì)厚樸酚及和厚樸酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)選方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單可行，符合我院實(shí)際應(yīng)用。另外，優(yōu)化的提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果符合預(yù)期，說明其有效、合理、穩(wěn)定可行，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)。

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