葉蛋白提取分離及應(yīng)用研究進(jìn)展

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(1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海西寧810008; 2.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京100049)

葉蛋白提取分離及應(yīng)用研究進(jìn)展

柳青海1，2，張?zhí)苽?，2，李天才1

(1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海西寧810008; 2.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京100049)

葉蛋白因具有資源豐富、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、不含動(dòng)物性膽固醇等特點(diǎn)而備受關(guān)注，是一種具有良好開發(fā)價(jià)值的新型蛋白資源。細(xì)胞破碎的方法主要有研磨、組織搗碎等方法;提取的方法主要有酸(堿)加熱提法、發(fā)酵法、有機(jī)溶劑沉淀等方法;分離純化的方法主要有電泳、色譜等方法。葉蛋白在醫(yī)藥、食品、飼料等方面都有廣泛的應(yīng)用。

葉蛋白，提取分離，細(xì)胞破碎，應(yīng)用

1.1.1 研磨 劉建華等［6］采用干打漿的方法，將魯梅克斯嫩葉莖剪切成長(zhǎng)0.5～1cm的小段，分?jǐn)?shù)次用研缽研磨成糊狀，醫(yī)用紗布兩層疊放在一起，每次取少許研磨后的糊狀物放在紗布上，充分?jǐn)D壓，擠出綠色汁液，從而分離出葉蛋白。該方法簡(jiǎn)單，經(jīng)常與其他方法結(jié)合使用。

1.1.2 組織搗碎法 這是一種較劇烈的破碎細(xì)胞的方法，通?？上扔眉矣檬称芳庸C(jī)將組織打碎，然后再用10000～20000r/min的內(nèi)刀式組織搗碎機(jī)(即高速分散器)將組織的細(xì)胞打碎。宋葆華等［7］在ZK高速自控組織搗碎機(jī)中，加蒸餾水300mL，搗碎3min，比較107種植物中葉蛋白含量。

1.1.3 溶脹法 細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞膜脹破釋放出細(xì)胞內(nèi)含物。闞歡等［8］用100∶1的液料比，浸泡60min，從辣木葉中分離葉蛋白。李雪楓等［9］用此方法破碎柱花草葉細(xì)胞，從中提取葉蛋白。

1.2 提取方法

1.2.1 酸(堿)加熱提法 酸(堿)加熱提法是酸(堿)法和加熱法相結(jié)合的一種復(fù)合型葉蛋白提取方法。葉蛋白經(jīng)等電點(diǎn)沉淀和熱變性雙重因素共同作用，增加了蛋白質(zhì)凝聚機(jī)會(huì)，使葉蛋白凝聚快、凝聚物結(jié)構(gòu)緊密易分離，保證了葉蛋白的高提取率。吳峰華等［10］利用堿提酸沉法，考察了提取溫度、提取時(shí)間、pH和料液比對(duì)豆腐柴葉蛋白提取率的影響，表明溫度為50℃，時(shí)間為80min，pH為11，料液比為1∶30，豆腐柴葉蛋白提取率可達(dá)到82.04%。趙希艷等［11］采用紫花苜蓿葉為原料，酸(堿)加熱法提取紫花苜蓿葉蛋白，確定獲得葉蛋白高產(chǎn)率的最優(yōu)條件為:pH4.5、溫度80℃，加熱時(shí)間5min。酸(堿)加熱法的主要優(yōu)點(diǎn)是流程短操作方便、沉淀快、易于過濾收集等。但該工藝的缺點(diǎn)是酸(堿)等條件造成蛋白水解、影響蛋白活性。

1.2.2 發(fā)酵法 利用乳酸菌產(chǎn)生的乳酸等改變漿液的pH到蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，使蛋白沉淀，再通過離心得到葉蛋白。曾凡枝等［12］用該法從苜蓿中提取葉蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對(duì)苜蓿葉蛋白提取率的影響順序?yàn)?發(fā)酵溫度＞乳酸菌數(shù)＞發(fā)酵時(shí)間，實(shí)驗(yàn)發(fā)酵時(shí)間10h左右，發(fā)酵溫度34℃。劉鵬等［13］將乳酸的發(fā)酵酸與植物葉榨汁液按體積比3∶1混合，攪拌靜置后，離心得到葉蛋白沉淀，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵酸新鮮程度、乳酸菌數(shù)量多少、生物活性高低等因素，對(duì)葉蛋白聚凝和提取效率都有影響。發(fā)酵法提取葉蛋白的優(yōu)點(diǎn)是使植物葉中對(duì)動(dòng)物機(jī)體有害的物質(zhì)失去活性，提高了蛋白質(zhì)品質(zhì)，能耗少，提取效率高，是生產(chǎn)葉蛋白的一種節(jié)能環(huán)保的優(yōu)良工藝。

1.2.3 有機(jī)溶劑沉淀 Walter J.Bray等［14］用聚丙烯酰胺A150可高效的提取紫花苜蓿和黑麥草汁液中的白色葉蛋白。韋吉等［15］研究不同提取條件對(duì)熱研號(hào)柱花草葉蛋白凝集的影響，表明其溶劑的選擇及質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH、加熱時(shí)間和溫度對(duì)蛋白提取均有影響。有機(jī)溶劑提取法是目前較為常見的提取葉蛋白的方法，其優(yōu)點(diǎn)是沉淀快、絮凝物結(jié)構(gòu)緊密，易過濾收集。且經(jīng)有機(jī)溶劑脫色生產(chǎn)的脫色葉蛋白具有含糖量低、蛋白成分較為單一等高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可用于抗癌、營(yíng)養(yǎng)保健食品的開發(fā)。

1.2.4 直接加熱法 劉建華等［6］用魯梅克斯做原料比較了直接加熱法、凝絮法和加酸法3種提取方法，結(jié)果直接加熱法提取葉蛋白的產(chǎn)率相對(duì)較高。施正香等［7］研究表明，直接加熱法能較好地促使葉蛋白絮凝，加熱溫度對(duì)葉蛋白提取效果有明顯影響，50℃和90℃是提取率最高的兩個(gè)點(diǎn);植株葉的幼嫩程度對(duì)葉蛋白提取率有影響，在處理溫度相同時(shí)，同種植物越幼嫩，葉蛋白絮凝沉淀越容易，葉蛋白提取率越高。李雪楓等［9］用此方法提取柱花草葉蛋白，提取溫度為80℃。鄒文輝等［16］對(duì)草坪草屑葉蛋白提取方法進(jìn)行比較，直接加熱法和酸化加熱法之間無顯著差異，但直接加熱法具有較好的絮凝沉淀效果，且容易過濾，因此，直接加熱法是提取草坪草屑葉蛋白的一種較好的方法。

1.2.5 其他方法 葉蛋白的提取方法還有超濾法、等電點(diǎn)沉淀法、結(jié)晶和重結(jié)晶法、酸堿法等，也有將不同的提取方法綜合在一起使用的。Werner Koschuh等［17］用超濾法從黑麥汁液中提取葉蛋白的得率為59%，而用加熱法的得率為45%。闞歡等［8］用浸提及等電點(diǎn)法從辣木中提取分離葉蛋白，等電點(diǎn)分離 pH為4.0～5.0時(shí)，產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量達(dá)68.86%，蛋白質(zhì)提取率達(dá)70%。Aruna RPGA等［18］用酸提法從廢茶葉渣中提取葉蛋白，pH4.4時(shí)，葉蛋白提取率達(dá)69%。劉曉穎［19］以黑麥草為原料采用酸加熱和有機(jī)溶劑相結(jié)合的方法對(duì)其葉蛋白進(jìn)行抽提，測(cè)得葉蛋白中粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)32%～58%?？梢钥闯?，將有機(jī)溶劑提取和酸化加熱法結(jié)合在一起可以獲得較高的蛋白提取率。如果能在方法上得到進(jìn)一步的改變，使得葉蛋白提取的成本降低，將為我們尋求新的蛋白資源提供更多的選擇。

2 葉蛋白分離純化

葉蛋白中含有多種蛋白，通過一系列物理、化學(xué)、生物等技術(shù)將其分開，得到相對(duì)較純的蛋白，有利于葉蛋白的進(jìn)一步研究，尋找新的活性蛋白，對(duì)開發(fā)葉蛋白有著重要意義。目前純化蛋白的方法主要有電泳法、色譜等方法。

2.1 電泳法

帶電荷的供試品(蛋白質(zhì)粗提液)在惰性支持介質(zhì)(如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)中，于電場(chǎng)的作用下，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng)，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，達(dá)到對(duì)不同物質(zhì)的分離。謝正軍等［20］用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將苜蓿葉提取的粗蛋白分成不同的組分，確定其分子量大小。Gomez-Vidal S等［21］用二維電泳的方法(2-DE)從棗椰樹葉中分離出五種純蛋白。Silas Pessini Rodrigues等［22］用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)從番木瓜葉中提取出15種蛋白。

2.2 色譜法

2.2.1 凝膠過濾 根據(jù)分子量大小不同在色譜柱中的分配速度不同，分子量大的流出較分子量小的快，進(jìn)而將其分離。馬麗等［23］用葡聚糖凝膠G-200凝膠色譜及Sephadex A.50，從元寶楓葉片中提取并純化了葉蛋白，其中蛋白酶的比活性為1408.04U·mg-1，純化倍數(shù)50.77。Mylarappa Bantaganahalli Ningappa等［24］用Sephadex G-75和Sephadex G-25從麻絞葉中分離純化出一種蛋白，該蛋白分子量為35kDa。Pereira CA等［25］用Q-瓊脂糖凝膠(Q-Sepharose)從木薯葉中分離蛋白。

2.2.2 離子交換層析 根據(jù)蛋白帶電性質(zhì)的不同，與交換劑發(fā)生交換，改變洗脫液pH或離子強(qiáng)度，將其洗脫而達(dá)到分離的目的。Dhira j.Vyas等［26］用DEAE-cellulose從茶葉蛋白提取物中分離出具有抗氧化作用的蛋白。Sharma P等［27］用DEAE從水稻葉中分離出具有活性的兩種蛋白，其分子量28.5kDa和34kDa。

3 葉蛋白應(yīng)用研究

3.1 藥用價(jià)值

國(guó)內(nèi)外在葉蛋白藥用方面研究的較多，如葉蛋白在抗氧化、預(yù)防心血管病、抗腫瘤、治療關(guān)節(jié)炎、肺氣腫、老年性白內(nèi)障等方面的作用有研究報(bào)道。

3.1.1 抗氧化 謝正軍等［20］對(duì)苜蓿葉蛋白及其水解產(chǎn)物抗氧化實(shí)驗(yàn)研究表明，苜蓿葉蛋白水解產(chǎn)物具有明顯的抗氧化功能。傅曉［28］用苜蓿葉蛋白對(duì)大鼠飼養(yǎng)結(jié)果證實(shí)，葉蛋白可提高谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧物歧化酶(SOD)的活力，降低氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的濃度，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)的功能。Mylarappa Bantaganahalli Ningappa等［24］從麻絞葉中分離出蛋白，該蛋白具有抗氧化和清除自由基的作用。Dhira j.Vyas等［26］從茶葉蛋白提取物中分離出具有抗氧化作用的蛋白。Sharma P等［27］從水稻葉中分離出兩種具有活性的蛋白，有顯著的抗氧化作用。

3.1.2 預(yù)防心血管病 活潑等［29］從茶葉中提取蛋白，通過實(shí)驗(yàn)證明其具有明顯的降血脂效果，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化及冠心病可能有一定的預(yù)防作用。鄧勇等［30］通過苜蓿葉蛋白強(qiáng)化膳食營(yíng)養(yǎng)學(xué)實(shí)驗(yàn)證明:進(jìn)食苜蓿葉蛋白能明顯提高大學(xué)生血紅蛋白的含量，改善貧血狀況。EWA D.Marczak等［31］研究結(jié)果表明，從菠菜中提取葉蛋白對(duì)高血壓小鼠的血管緊張素轉(zhuǎn)移酶活性有顯著的抑制作用，能夠起到降血壓作用。

3.1.3 抗菌作用 Kyoko Hayashi等［32］研究表明，從絲蘭屬植物葉中提取的葉蛋白，能阻止單純皰疹病毒感染細(xì)胞后蛋白合成系統(tǒng)，從而阻止其在宿主細(xì)胞內(nèi)繁殖，該發(fā)現(xiàn)對(duì)開發(fā)植物的葉蛋白具有重要意義。

3.2 保健食品

粗葉蛋白富含維生素和葉黃素，不含動(dòng)物蛋白所含的膽固醇，可作為兒童和成人的食用蛋白源和食品添加劑，被聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織認(rèn)為是一種高質(zhì)量食品。鄭建仙［33］將苜蓿葉蛋白應(yīng)用到面條中，在添加量不超過4%時(shí)，不改變面團(tuán)流變學(xué)特性和口感;即使苜蓿葉蛋白的加入量達(dá)5%，也不會(huì)影響面條的加工性能。Devadas等［34］將苜蓿葉蛋白作為食物實(shí)驗(yàn)研究表明:其容易消化，還可促進(jìn)生長(zhǎng)，同動(dòng)物蛋白相比，其成本低廉，在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)是一種理想的食品。Prevot-Dalvise等［35］用酶膜反應(yīng)器水解苜蓿葉蛋白分離制備的葉蛋白肽，其溶解性、乳化性能、發(fā)泡性能均有較大改善，可用于食品工業(yè)。葉蛋白對(duì)人體具有多種功能，它進(jìn)入人們的膳食結(jié)構(gòu)后，將會(huì)降低高膽固醇對(duì)健康的危害。

3.3 飼料方面

葉蛋白含有動(dòng)物必需氨基酸，粗蛋白質(zhì)含量較高，是豬、雞、牛、羊良好的蛋白質(zhì)補(bǔ)充飼料。對(duì)家畜適口性好、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、明顯增加體重、改善禽畜魚蛋等產(chǎn)品品質(zhì)、具有良好的飼養(yǎng)效果，可作為家畜飼料添加劑，也可直接制成葉蛋白飼料直接進(jìn)行飼喂。Delic［36］用含50%粗蛋白的苜蓿葉蛋白濃縮物代替蛋雞日糧中3%的大豆餅，產(chǎn)蛋率增加3%，平均蛋重由55.8g提高到57.7g，飼養(yǎng)成本降低，蛋黃中β-胡蘿卜素含量增加14%，且蛋黃中葉黃素積累增多，色澤提高。李玉清等［37］實(shí)驗(yàn)表明，在蛋雞生產(chǎn)中用5%、10%菠菜葉蛋白替代相應(yīng)比例的豆粕飼喂“種禽褐”商品代蛋雞，生產(chǎn)性能不受影響;同時(shí)還可提高蛋黃顏色和經(jīng)濟(jì)效益。潘行正等［38］在飼料中添加西蘭花葉蛋白對(duì)仔豬生產(chǎn)性能的實(shí)驗(yàn)表明，適量添加葉蛋白對(duì)斷奶仔豬的采食量影響不顯著，但添加量提高到6%時(shí)可顯著影響仔豬的采食量，在飼料轉(zhuǎn)化率方面，3%葉蛋白組效率最高，表明西蘭花葉可用于代替等量日食的飼料。

3.4 其他方面用途

葉蛋白除了用于醫(yī)藥、保健食品、飼料外，還可用于化妝品、洗滌用品等日用化工用品和植物生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)劑等方面，也可將葉蛋白作為原料進(jìn)一步分離制得葉綠素、胡蘿卜素、純蛋白質(zhì)、維生素E等許多功能性物質(zhì)，而且葉蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域正在不斷拓寬。葉蛋白純化后活性蛋白研究，以及多肽等的研究越來越多。

4 前景與展望

葉蛋白資源豐富，加工過程簡(jiǎn)單，成本低，有利于規(guī)模化生產(chǎn)，而國(guó)內(nèi)在葉蛋白的深加工方面相對(duì)滯后，目前國(guó)內(nèi)對(duì)葉蛋白的研究主要集中于提取，而對(duì)于其進(jìn)一步深加工研究較少，需要在葉蛋白應(yīng)用方面進(jìn)行更多的研究，使其生產(chǎn)加工能形成產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化，深加工產(chǎn)品能廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等方面，獲得更大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。國(guó)內(nèi)對(duì)蛋白需求大，尤其是畜牧養(yǎng)殖業(yè)，而國(guó)內(nèi)蛋白資源相對(duì)缺乏，所以葉蛋白具有良好的開發(fā)前景。

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Review on extraction，purification and application of leaf protein

LIU Qing-hai1，2，ZHANG Tang-wei1，2，LI Tian-cai1
(1.Northwest Institute of Plateau Biology Chinese Academy of Science，Xining 810008，China; 2.Graduate University，Chinese Academy of Science，Beijing 100049，China)

Leaf protein has been paid much attention for its plenty of sources，high nutrition and nocholesterol，it was a new type of protein resources.Methods to crash cell included grinding，crushing and other methods.Crude leaf protein extraction methods were acid heating，the direct fermentation，organic solvent precipitation and other methods.Protein separation and purification methods included electrophoresis，chromatography and so on.Leaf protein widely used in medicine，food，feed and so on.

leaf protein;extraction and purification;cell breakage;application

TS201.2+1

A

1002-0306(2011)09-0468-04

葉蛋白(Leaf protein concentration，LPC)是從新鮮植物莖葉，經(jīng)壓榨取汁、液中蛋白質(zhì)分離和濃縮干燥而制備的高質(zhì)量濃縮物［1］。研究表明，葉蛋白制品含蛋白質(zhì)50%～70%［2］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，苜蓿葉蛋白食用效果好，可消化率為62%～72%，能量代謝率為69%～90%，每千克葉蛋白中代謝能為 2800～3200kcal［3］。葉蛋白中含有18種氨基酸，其中含8種人體必需氨基酸，錢愛萍等［4］研究表明，烏飯樹葉蛋白質(zhì)中總氨基酸含量為71.82%，必需氨基酸(EAA)占總氨基酸量的40.30%，第一限制性氨基酸為賴氨酸，氨基酸比值系數(shù)為77.05，必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值為0.674，分別高于WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的40%和0.6。遲桂榮［5］對(duì)菹草和浮萍研究表明，這兩種植物中葉蛋白中粗蛋白含量為51.6%和42.3%。國(guó)內(nèi)外對(duì)葉蛋白應(yīng)用研究，主要集中在藥用(抗氧化、心血管病、抗菌等)、食品、飼料等方面。我國(guó)植物資源豐富，而在葉蛋白開發(fā)方面相對(duì)滯后，積極尋求開發(fā)新的蛋白資源具有十分重要的意義。

1 葉蛋白的提取

1.1 樣品的預(yù)處理

2010-09-09

柳青海(1985-)，男，碩士研究生，研究方向:藥用植物化學(xué)。