張 艷 靳衛(wèi)國(guó)

(1.泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000；2.聊城市人民醫(yī)院，山東 聊城 252000)

氧是需氧生物必不可少的基本物質(zhì)，需氧細(xì)胞在物質(zhì)能量過(guò)程中，如果氧未被完全還原成水，可產(chǎn)生氧自由基，這些氧自由基可轉(zhuǎn)變成一些非自由基氧活性物質(zhì)，由于功能上的相似性，這些物質(zhì)被統(tǒng)稱為活性氧(reactive oxygen species ,ROS)，ROS對(duì)細(xì)胞功能如生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化、凋亡、癌變和衰老發(fā)揮重要的作用。乏氧是腫瘤微環(huán)境的基本特征，乏氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor-1 alpha, HIF-1) 是各種低氧誘導(dǎo)基因調(diào)節(jié)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子, HIF-1 的作用主要取決于HIF-1α亞基的表達(dá)和活性。結(jié)合兩者近年來(lái)的研究進(jìn)展作簡(jiǎn)要綜述。

1 活性氧概述

1.1 活性氧的產(chǎn)生和代謝

細(xì)胞的生存離不開(kāi)氧的供應(yīng)。ROS是需氧細(xì)胞在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的以各種形式的氧自由基和非自由基形式存在的含氧化合物的總稱。包括超氧陰離子( superoxide anion，O2ˉ)、羥自由基(·OH)、過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)及脂質(zhì)過(guò)氧化物(ROOH)。這是一類比分子氧化學(xué)反應(yīng)性更活活潑的一類含氧物質(zhì)，含有未成對(duì)電子，極不穩(wěn)定[1]。

生理情況下，體內(nèi)大約2%的氧消耗于線粒體內(nèi)，線粒體是ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，呼吸鏈(MRC)[2]中的酶復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ漏出的電子能與O2結(jié)合生成ROS。其他產(chǎn)生ROS的部位包括：NADH氧化物酶復(fù)合體途徑[3]、磷脂酶A2激活的花生四烯酸代謝途徑[4]、黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶途徑[5]、蛋白激酶C、脂氧合酶系以及環(huán)氧合酶系等，其中NADH氧化酶系統(tǒng)最重要。

機(jī)體在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了抗氧化應(yīng)激機(jī)制，正常情況下，細(xì)胞產(chǎn)生的少量ROS 可被內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)包括抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)滅活，從而保護(hù)細(xì)胞免受自身代謝產(chǎn)物的損傷[6,7]。這些抗氧化酶類主要包括：超氧化物岐化酶( superoxide dismutase, SOD) 、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶( glutathione peroxidase, GPX)及過(guò)氧化氫( catalase, CAT)等，而抗氧化物質(zhì)主要有：還原型谷胱甘肽( reduced glutathione hormone, GSH) 、硫氧還蛋白( thionredoxin, TRX) 、維生素E、胡蘿卜素、維生素C及一些游離氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)等。

1.2 活性氧與腫瘤的發(fā)生機(jī)制

在病理情況下，如：氧分壓改變、激素、細(xì)胞因子和化學(xué)物質(zhì)等均可引起的ROS 增加。當(dāng)體內(nèi)ROS產(chǎn)生數(shù)量超過(guò)機(jī)體抗氧化能力，就會(huì)損傷蛋白質(zhì)、DNA、多糖和脂質(zhì)，該過(guò)程被稱為氧化應(yīng)激(oxidative stress)。隨著ROS研究的不斷深入，它在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要作用已被證實(shí)，體內(nèi)活性氧與抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)的失衡是腫瘤形成的關(guān)鍵因素，大量研究結(jié)果顯示ROS參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[7-9]。

1.2.1ROS導(dǎo)致的DNA損傷 ROS是極強(qiáng)的氧化劑，當(dāng)其在機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)聚集可造成DNA損傷，產(chǎn)生DNA斷裂、堿基互換、姐妹染色體交換、DNA加合物形成、染色體基因突變等，這是ROS誘導(dǎo)細(xì)胞癌變的主要原因。ROS誘導(dǎo)的DNA氧化性損傷的主要方面是堿基結(jié)構(gòu)的損傷，其中·OH是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單 、反應(yīng)活性最高的活性氧。ROS還可通過(guò)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)來(lái)調(diào)控細(xì)胞多種代謝過(guò)程。ROS可氧化DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的巰基，從而改變與DNA結(jié)合的能力，引發(fā)癌基因的表達(dá)。另外，活性氧以協(xié)同方式激活轉(zhuǎn)錄因子NF-KB 和MAP激酶(絲氨酸/蘇氨酸激酶)，以啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄影響腫瘤細(xì)胞的增殖。

1.2.2ROS導(dǎo)致蛋白質(zhì)損傷 活性氧對(duì)蛋白質(zhì)的作用包括修飾氨基酸，使肽鏈斷裂，形成蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚合物，改變構(gòu)象和免疫原性等5個(gè)方面。一是修飾氨基酸。蛋白質(zhì)分子中起關(guān)鍵作用氨基酸成分對(duì)自由基損害特別敏感，以芳香氨基酸和含硫氨基酸最為突出，不同的自由基對(duì)特定氨基酸側(cè)鏈有特殊影響。二是使肽鏈斷裂?；钚匝跛碌鞍踪|(zhì)肽鏈斷裂方式有2種，一種是肽鏈水解，另一種是從α-碳原子處直接斷裂，究竟以何種方式斷裂取決于活性氧和蛋白質(zhì)的類別、濃度和二者之間的反應(yīng)速率。三是形成蛋白質(zhì)交聯(lián)聚合物。多種機(jī)制可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)的交聯(lián)和聚合。蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸可以形成二酪氨酸，半胱氨酸氧化形成二硫鍵，兩者均可以形成蛋白質(zhì)的交聯(lián)。交聯(lián)可以分為分子內(nèi)交聯(lián)和分子間交聯(lián)2種形式。蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和半胱氨酸的數(shù)目可以決定交聯(lián)的形式。另外，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的丙二醛與蛋白質(zhì)氨基酸殘基反應(yīng)生成烯胺，也可以造成蛋白質(zhì)交聯(lián)。四是改變構(gòu)象。蛋白質(zhì)經(jīng)氧化后，熱動(dòng)力學(xué)上不穩(wěn)定，部分三級(jí)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，失去原有構(gòu)象。五是改變免疫原性。.

1.2.3ROS對(duì)生物膜的損傷 自由基作用于細(xì)胞膜及亞細(xì)胞器膜上的多不飽和脂肪酸，可使其發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，脂質(zhì)過(guò)氧化的中間產(chǎn)物可與膜蛋白發(fā)生反應(yīng)生成蛋白質(zhì)自由基，使蛋白質(zhì)發(fā)生聚合和交聯(lián)；另一方面自由基還可直接與膜上的酶或其受體共價(jià)結(jié)合。這些氧化損傷破壞了鑲嵌于膜系統(tǒng)上的許多酶和受體、離子通道的空間構(gòu)型，破壞膜的完整性，使膜流動(dòng)性下降，膜脆性增加，細(xì)胞內(nèi)外或細(xì)胞器內(nèi)外物質(zhì)和信息交換障礙，影響膜的功能與抗原特異性，導(dǎo)致廣泛性損傷和病變。

1.2.4其它因素 研究表明，ROS可促使致癌物質(zhì)產(chǎn)生。如：2-氨基-3,4二甲基異吡唑喹啉和2-氨基-3-甲基異吡唑喹啉等雜環(huán)胺類[10]。ROS也可影響端粒酶的活性，而端粒酶通過(guò)調(diào)控染色體端粒的長(zhǎng)短來(lái)決定細(xì)胞的分裂、分化、衰老和死亡、以及癌變等多種過(guò)程。

2 乏氧誘導(dǎo)因子-1α

實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展依賴于血供系統(tǒng)，新生的腫瘤脈管通常不規(guī)則、異常彎曲、動(dòng)靜脈短路或呈盲端或血管壁不完整，導(dǎo)致血流緩慢，腫瘤細(xì)胞所需的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，乏氧是實(shí)體瘤微環(huán)境的基本特征，乏氧不僅改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定性及惡性選擇，與腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)，也是腫瘤對(duì)放、化療產(chǎn)生抗性的主要原因之一。

2.1 乏氧誘導(dǎo)因子-1α的結(jié)構(gòu)與功能

在乏氧情況下，腫瘤細(xì)胞組織的許多基因都會(huì)對(duì)乏氧做出應(yīng)激反應(yīng)，在該過(guò)程中起中樞性調(diào)節(jié)作用的因子就是乏氧誘導(dǎo)因子-1 (hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)。 HIF-1是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子,它是由α和β2個(gè)亞基組成的異二聚體。HIF-1α基因定位于染色體14q21～q24,而HIF-1β基因定位于染色體1q21。α和β2個(gè)亞基均屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋/PAS ( bHLH-PAS)蛋白家族成員。HIF-1α分子的氨基端方向依次排列著堿性區(qū)域、HLH 和PAS,共同構(gòu)成轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。HIF-1α羧基端有兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的反式激活結(jié)構(gòu)域( transactivation domain, TAD) ,分別稱之為TAD-N (氨基酸531～575)和TAD-C (氨基酸813～826) ,參與轉(zhuǎn)錄活化,二者之間為抑制結(jié)構(gòu)域,能降低TAD的活性,常氧下抑制明顯。HIF-1α分子中部是氧依賴降解結(jié)構(gòu)域,控制其常氧降解。HIF-1α是HIF-1所特有的,它既是HIF-1的調(diào)節(jié)亞基,又是活性亞基,其蛋白穩(wěn)定性和活性均受細(xì)胞內(nèi)氧濃度的調(diào)節(jié),在常氧條件下HIF-1α水平下降明顯,很難檢測(cè)到。HIF-1β是許多轉(zhuǎn)錄因子所共有的亞基,為芳羥受體核轉(zhuǎn)位子( the aryl hydrocarbon recep tor nuclear translocator,ARNT)基因的產(chǎn)物,又稱芳羥受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,具有789或744個(gè)氨基酸殘基,僅含一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活區(qū),定位于C末端。HIF-1β在細(xì)胞內(nèi)呈構(gòu)成性表達(dá),不受氧濃度的調(diào)節(jié),可存在于任何氧濃度下。只有HIF-1α入核后與HIF-1β形成異二聚體才能成為有活性的HIF-1[11]。研究證明：HIF-1α僅存在于乏氧細(xì)胞核內(nèi)，常氧狀態(tài)下檢測(cè)不到，與腫瘤的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。

乏氧狀態(tài)下，腫瘤細(xì)胞的多種基因轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生改變，這些基因的啟動(dòng)子多含有乏氧反應(yīng)元件(HRE)，HIF-lα通過(guò)HRE調(diào)節(jié)多種靶基因如：VEGF、EPO、GLUT-1、3和糖酵解酶的表達(dá)，影響血管發(fā)生、細(xì)胞能量代謝、離子代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)等。

2.2 HIF-1α與腫瘤的作用機(jī)制

2.2.1HIF-1α與腫瘤的血管生成

在眾多調(diào)節(jié)中腫瘤血管形成的因子如：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子( vascular endothelial growth factor, VEGF) 、表皮生長(zhǎng)因子( ep idermal growth factor, EGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子( fibroblast growth factor, FGF)中,乏氧引起VEGF的表達(dá)上調(diào)已得到公認(rèn),上調(diào)的VEGF可協(xié)助腫瘤細(xì)胞進(jìn)入脈管系統(tǒng),從而增加腫瘤轉(zhuǎn)移率。Fang等[12]證實(shí),在腫瘤發(fā)生早期HIF-1α介導(dǎo)了VEGF的上調(diào)。Schoppmann等[13]研究發(fā)現(xiàn), HIF-1α與VEGF-C有顯著的相關(guān)性,且與微血管密度有明顯關(guān)聯(lián)。Skinner等[14]發(fā)現(xiàn)HIF-1α的表達(dá)通過(guò)活化P I3K/AKT信號(hào)通路在轉(zhuǎn)錄水平介導(dǎo)VEGF蛋白的表達(dá)。

2.2.2HIF-1α對(duì)腫瘤細(xì)胞間黏附的影響

當(dāng)腫瘤細(xì)胞處于低氧狀態(tài)時(shí)，腫瘤細(xì)胞間黏附力下降，同時(shí)侵襲組織和血管的能力增強(qiáng)。研究表明,在諸多與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)的黏附分子中,上皮型鈣粘素( E-cadherin, E-cad)與β鏈接素(β-catenin,β-cat)起重要作用, E-cad /β-cat復(fù)合體的破壞可使細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)間的黏附性降低,最終導(dǎo)致細(xì)胞的分離和移動(dòng)；同時(shí)兩者亦是上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化( epithelial-mesen-chymal transition , EMT)中的關(guān)鍵蛋白,而EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要現(xiàn)象。HIF-1α可通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞黏附分子的表達(dá)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。在晚期卵巢癌患者腫瘤組織中能檢測(cè)到在H IF-1α高表達(dá)的同時(shí), E-cad和β-cat在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)降低。Imai等[15]應(yīng)用Northern- blotting、RT-PCR和Westernblotting實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下卵巢癌細(xì)胞系中E-cad的表達(dá)明顯減少, 導(dǎo)致細(xì)胞間黏附作用減小,促進(jìn)腫瘤侵襲, 可能是導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移的始動(dòng)因素, 同時(shí)發(fā)現(xiàn)其機(jī)制可能是乏氧上調(diào)Snail( E-cad轉(zhuǎn)錄抑制因子) 表達(dá)。Ohga 等[16]研究發(fā)現(xiàn)乏氧本身可直接激活NF-κB, 而ICAM-1( 細(xì)胞間黏附分子-1) 基因的啟動(dòng)子含有NF-κB 作用位點(diǎn), 因此可認(rèn)為乏氧通過(guò)激活NF-κB 進(jìn)而促進(jìn)ICAM-1的表達(dá),促進(jìn)腫瘤侵襲的發(fā)生。Howard等[17]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中E-cad 的表達(dá)與HIF-1α的表達(dá)明顯相關(guān)。

2.2.3HIF-1α對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

腫瘤細(xì)胞的凋亡有p53依賴性和非依賴性兩條途徑, 而乏氧是通過(guò)HIF-1α介導(dǎo)p53 依賴途徑而發(fā)揮作用。Carmeliet 等發(fā)現(xiàn)乏氧時(shí)野生型胚胎干細(xì)胞(ES,HIF-1α+/+ ) 的HIF-1α和p53 表達(dá)均增加。研究表明HIF-1α可選擇性地使p53 突變或p53 缺失的瘤細(xì)胞凋亡受阻, 使腫瘤惡性程度更高。Bcl-2為凋亡抑制因子, Bcl-2可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡而增強(qiáng)膀胱癌的轉(zhuǎn)移能力。Acs等[18]發(fā)現(xiàn)HIF-1α可調(diào)Bcl-2表達(dá)，抑制凋亡, 從而增強(qiáng)腫瘤轉(zhuǎn)移能力。HIF-1α亦可上調(diào)凋亡抑制因子p21, 從而抑制凋亡使腫瘤惡性程度增加易于轉(zhuǎn)移。

3 活性氧對(duì)HIF-1α的影響

HIF-1α有1 個(gè)氧依賴調(diào)節(jié)區(qū)(ODD) ，2 個(gè)轉(zhuǎn)錄活性區(qū)( TAD) 。正常氧分壓條件下，ODD 的2 個(gè)脯氨酸殘基( P402 和P564) 被脯氨酸羥化酶( PHD) 羥化，導(dǎo)致HIF-1α與抑癌蛋白VHL 結(jié)合，啟動(dòng)HIF-1α的泛素化和蛋白水解過(guò)程。在這一過(guò)程中，PHD被確定為氧感受器，其活性受氧分壓調(diào)節(jié)。

而更多的研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是缺氧或非缺氧情況，ROS 均參與HIF 活性的調(diào)節(jié)。研究表明 HIF-1α對(duì)氧依賴性較強(qiáng)，HIF-1α蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性在mRNA、蛋白、核定位及轉(zhuǎn)錄激活等不同層次受細(xì)胞內(nèi)氧濃度的精確調(diào)控[19]，當(dāng)周圍環(huán)境的氧濃度下降時(shí)，HIF-1α表達(dá)增加，與靶基因上的HRE結(jié)合[20],誘導(dǎo)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng),如：作用于促紅細(xì)胞生成素( erythropoietin, EPO)使血紅蛋白合成增加，增強(qiáng)在低氧環(huán)境下的攜氧能力；增加與無(wú)氧代謝有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄(包括糖酵解酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子等)而使ATP生成增加；上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子( vascular endothelial growth factor, VEGF)的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤新生血管形成；此外還可調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá),如胰島素樣生長(zhǎng)因子-2、內(nèi)皮素-1、轉(zhuǎn)鐵蛋白、葡萄糖載體蛋白-1及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子等,這些產(chǎn)物參與腫瘤細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)、凋亡及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等。

研究表明，腫瘤細(xì)胞在乏氧狀態(tài)下產(chǎn)生的ROS增多[21]，ROS可通過(guò)抑制 PHD活性對(duì)HIF-1α發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。而在常氧狀態(tài)下, 腫瘤組織內(nèi)HIF-1α的含量與活性調(diào)節(jié)主要依賴生長(zhǎng)因子、血管活性肽和金屬離子等因素,這些因素可通過(guò)促進(jìn)ROS的產(chǎn)生來(lái)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。另外，許多非低氧刺激因素,如凝血酶、血管緊張素和機(jī)械性刺激等，可通過(guò)NADPH氧化酶調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平和HIF-1α[22]。總之，乏氧和非乏氧刺激因素均可增加ROS水平，通過(guò)PHD、激酶和磷酸酶等上游信號(hào)通路，正向調(diào)節(jié)HIF-1α水平和活性。

4 結(jié)論與展望

實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制非常復(fù)雜，ROS及機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的失衡在其中發(fā)揮重要作用，而乏氧是實(shí)體瘤發(fā)展過(guò)程中的普遍現(xiàn)象。具體機(jī)制未完全闡明，繼發(fā)的組織低氧使適應(yīng)低氧環(huán)境和低血糖的殘存細(xì)胞克隆繼續(xù)生長(zhǎng)，這是腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)及其對(duì)放化療抗拒的最根本原因。HIF-1α無(wú)疑成為腫瘤細(xì)胞克服缺氧，增強(qiáng)自身適應(yīng)能力的樞紐環(huán)節(jié)。雖然目前我們對(duì)ROS及HIF-1α系統(tǒng)有了一定的認(rèn)識(shí)，但仍有許多未解之謎：①HIF-1α具體的調(diào)控機(jī)制。②ROS及機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。③ROS對(duì)HIF-1α作用的具體影響等。全面詳盡地認(rèn)識(shí)腫瘤內(nèi)氧代謝異常，對(duì)我們認(rèn)識(shí)和治療腫瘤將開(kāi)辟新的途徑。

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