羅俊輝,鄒良?。?黃盛東,龔德軍,劉廣洛,馬春生

(1第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院,上海 200433;2中國人民解放軍第 150中心醫(yī)院)

ABCG2作為一種重要的腫瘤多藥耐藥蛋白,不僅在腫瘤的多藥耐藥中發(fā)揮作用,而且還是腫瘤干細(xì)胞的候選標(biāo)記物[1]。對其在腫瘤細(xì)胞中的分布及作用進(jìn)行研究具有重要意義。本研究觀察了食管癌組織中ABCG2的表達(dá)變化,并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集 80例新鮮食管癌及癌旁正常食管組織來源于長海醫(yī)院胸心外科2006年 1月 ～2007年1月行食管癌根治術(shù)的患者(所取標(biāo)本均經(jīng)患者知情同意),術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。手術(shù)切除腫瘤標(biāo)本5m in內(nèi),用無菌手術(shù)刀片切取數(shù)塊1 cm×1 cm ×1 cm的腫瘤組織(避開壞死部分)和距腫瘤組織盡量遠(yuǎn)的正常食管組織,立即置于液氮中保存。患者均行電話隨訪,了解術(shù)后生存時間(至2009年1月)。

1.2 ABCG2檢測 ①免疫組化染色：將組織從液氮中取出,常規(guī)石蠟包埋及切片,HE染色。用Envision法行ABCG2的免疫組化染色：切片置入0.01 M檸檬酸鹽緩沖液中,煮沸 20min修復(fù)抗原,血清封閉液封閉20min,一抗采用抗兔ABCG2單克隆抗體,DAB顯色,蘇木精襯染,封片后在顯微鏡下觀察。不加一抗作空白對照,人胎盤作陽性對照。ABCG2陽性表達(dá)為細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒。利用數(shù)碼相機(jī)拍攝切片的高倍視野(×400)病理照片,在電腦上計(jì)數(shù)ABCG2陽性細(xì)胞。每個病例取3張切片(正常組織和癌組織各 3張),每張切片取 5個高倍鏡視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù),取其平均數(shù)(每高倍視野),并按照以下標(biāo)準(zhǔn)確定該例的ABCG2分級：無陽性細(xì)胞為-(0級),陽性細(xì)胞1～30個為+(1級)、31～60個為++(2級)、61～90個為+++(3級)、90個為++++(4級),這樣80例病例均得出癌組織和正常組織的ABCG2分級,然后計(jì)算出80例癌組織的ABCG2平均分級。②West-ern blot檢測：采用ODG buffer裂解法提取組織蛋白質(zhì),用10%分離膠及 4%濃縮膠,100 V電泳約100 min,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,封閉液封閉,放置過夜;次日加稀釋ABCG2一抗(1∶1 000)、內(nèi)參一抗(1∶400),溫育1.5 h,TBSB清洗3次后加二抗(1∶4 000),溫育1.5 h后化學(xué)發(fā)光、顯影、定影。用UVP凝膠成像系統(tǒng)Labworks4.6軟件分析目標(biāo)蛋白條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。用配對t檢驗(yàn)確定ABCG2在食管癌及癌旁正常食管組織中的差異,用χ2檢驗(yàn)及Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析ABCG2的表達(dá)與食管癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織分型 所有標(biāo)本均經(jīng)HE染色確定病變類型,并明確正常組織無腫瘤侵犯。高分化鱗癌 22例,中分化鱗癌 48例,低分化鱗癌 10例。

2.2 免疫組化檢測ABCG2在食管癌組織中的表達(dá)在正常食管組織中,ABCG2主要位于食管上皮的棘細(xì)胞層,為連續(xù)性,以胞膜著色為主;在癌組織中, ABCG2多為巢團(tuán)狀分布,主要定位于癌細(xì)胞,尤其定位于癌巢的中心部位及正在分裂的細(xì)胞,胞膜及胞質(zhì)均有著色,在癌組織的血管內(nèi)皮也可見有ABCG2表達(dá)。有40例癌組織檢測到ABCG2(占50%),而在癌旁正常食管組織中有 27例檢測到ABCG2(占33.75%),兩者相比,P＜0.05。癌組織ABCG2表達(dá)的分級為0.84±0.99級,正常食管組織為0.43±0.73級,兩者相比,P＜0.05。在低分化的食管癌組織中,ABCG2的表達(dá)較高、中分化食管癌的ABCG2表達(dá)升高,但兩者相比,P＞0.05。

2.3 Western blot檢測ABCG2在食管癌中的表達(dá)80例食管癌組織與正常組織中ABCG2和β-actin產(chǎn)物條帶積分光密度值之比分別為0.37±0.19和0.30±0.15,ABCG2在癌組織中的表達(dá)水平為正常組織的1.22倍,兩者相比,P＜0.05。

2.4 ABCG2的表達(dá)與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系 ①免疫組化染色結(jié)果表明,術(shù)后3 a之內(nèi)死亡的患者癌組織中 ABCG2的表達(dá)量較生存組患者高(ABCG2表達(dá)-、+、++、+++、++++者死亡組分別為 11、17、8、5、2例,生存組分別為 29、6、1、1、0例),即患者的3年生存率與ABCG2的表達(dá)程度有關(guān)(P＜0.01)。ABCG2在癌組織中的表達(dá)量與癌病變位置、TNM分期以及患者的性別、年齡無關(guān)(P均＞0.05)。②Western blot結(jié)果表明,食管癌組織中ABCG2表達(dá)上調(diào)(T/N＞1)與患者的術(shù)后早期復(fù)發(fā)密切相關(guān)(T/N＞1者61例,其中術(shù)后早期復(fù)發(fā)27例、未復(fù)發(fā)34例;T/N＜1者19例,其中早期復(fù)發(fā)2例、未復(fù)發(fā) 17例;兩者相比,P＜0.01),而與患者年齡、性別、病程、病變部位、病理分型、TNM分期、分化程度及與患者是否接受術(shù)前化療等無關(guān)(P均＞0.05)。

3 討論

造成食管癌手術(shù)治療失敗的主要原因是術(shù)后復(fù)發(fā)。而造成食管癌術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因是體內(nèi)殘存癌細(xì)胞,包括在局部的癌細(xì)胞殘留和未被發(fā)現(xiàn)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。盡管手術(shù)加術(shù)后化療在理論上可以清除所有癌細(xì)胞,但由于腫瘤的耐藥導(dǎo)致部分癌細(xì)胞無法被清除,而成為腫瘤復(fù)發(fā)的根源。

ABCG2是介導(dǎo)腫瘤多藥耐藥的一個基因,分布于許多正常組織及腫瘤中。在正常組織中高表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)層、小腸、大腸上皮、腦和前列腺等,而在乳腺、肝臟、肺等組織中低表達(dá)(局部有高表達(dá))。其同樣存在于乳腺癌、胃癌、大腸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌及肺癌等實(shí)體瘤中[2,3]。表達(dá) ABCG2的細(xì)胞對米托蒽醌、柔紅霉素、阿霉素、拓?fù)涮婵?、sN-38(伊立替康的活性代謝物)等藥物耐藥,但其對長春新堿、紫杉醇和順鉑依然敏感[4]。ABCG2在毛細(xì)血管或小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)可能會對Western blot或PCR的檢測結(jié)果造成干擾,用免疫組化的方法可以確定腫瘤組織中ABCG2的表達(dá)并非是毛細(xì)血管或小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用,而是組織本身的表達(dá)。

與其他的大部分ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不同,ABCG2除了作為細(xì)胞耐藥的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,還與干細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞的功能及鑒定密切相關(guān)[5]。本研究免疫組化結(jié)果表明,ABCG2主要分布于食管癌增生活躍的部位,而且在食管癌組織中表達(dá)的高低與患者的中期生存率有關(guān)?；颊呤中g(shù)后的中期生存率和患者體內(nèi)殘存的癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移速度有關(guān)。高表達(dá)ABCG2的患者較低表達(dá)患者的中期生存率低,復(fù)發(fā)率則較低表達(dá)ABCG2的食管癌患者要高,說明ABCG2在食管癌的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)中扮演了重要的角色。這種作用的形成可能與ABCG2本身是一種耐藥蛋白有關(guān),他的升高也伴隨著食管癌耐藥性的升高,導(dǎo)致癌細(xì)胞對多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性。但ABCG2并不轉(zhuǎn)運(yùn)當(dāng)前食管癌中常用的鉑類,因此,患者預(yù)后差很可能和 ABCG2的其他特性有關(guān)。ABCG2本身并不單純是一種耐藥蛋白,它還是一種潛在的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn),SP陽性細(xì)胞較SP陰性細(xì)胞高表達(dá)ABCG2,高表達(dá)ABCG2的癌細(xì)胞很可能是腫瘤干細(xì)胞[1,6,7,8]。腫瘤干細(xì)胞與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等密切相關(guān),且腫瘤干細(xì)胞是天然耐藥的。在其他的一些腫瘤的研究中已經(jīng)有類似的報道,如在多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤的研究中,ABCG2陽性癌細(xì)胞較ABCG2陰性癌細(xì)胞的增殖速度和侵襲能力均有明顯上調(diào)[9]。因此,在食管癌中, ABCG2的高表達(dá)說明腫瘤組織中可能存在有較多量的腫瘤干細(xì)胞,其增殖能力和侵襲能力較ABCG2陰性細(xì)胞升高,同時其耐藥性也較ABCG2陰性細(xì)胞明顯升高,導(dǎo)致腫瘤的早期轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā),降低患者的生存率。因此,ABCG2可以作為食管癌患者預(yù)后的預(yù)測因子之一。

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