韓永增，王 贊，高洪文

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

小葉錦雞兒(Caraganamicrophylla)為豆科錦雞兒屬多年生飼用灌木，多分布于中國東北及內(nèi)蒙古、河北、山西、陜西等地，蒙古、西伯利亞也有分布[1]。因其耐干旱、低溫，能抗風(fēng)沙，再生力強，耐瘠薄等特性而成為良好的飼用灌木和生態(tài)保護先鋒植物。微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)Simple sequence repeats(SSR)， 是一種基于DNA長度多態(tài)性的分子標記技術(shù)，具有共顯性、高度可重復(fù)性及多態(tài)性豐富等優(yōu)點，是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、研究群體遺傳學(xué)、進行分子標記輔助育種、系譜分析和法醫(yī)鑒定的理想工具[2-7]。目前國外已經(jīng)應(yīng)用該技術(shù)對很多物種進行了遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析研究[8-11]，國內(nèi)在牧草上也有部分應(yīng)用[12-13]，但在小葉錦雞兒上應(yīng)用SSR標記的研究卻很少[14]。其主要原因就是缺少用于小葉錦雞兒SSR分子標記的引物，而本研究所采用的引物為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草資源研究室自行開發(fā)的SSR引物，并利用正交試驗設(shè)計，對模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶濃度進行五因素四水平優(yōu)化篩選，從而建立高效、穩(wěn)定的小葉錦雞兒SSR-PCR反應(yīng)體系，為SSR標記在錦雞兒屬植物的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定、親緣關(guān)系分析及分子育種等研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 供試材料為24份小葉錦雞兒種質(zhì)資源，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草種質(zhì)庫提供，1號為體系優(yōu)化模板，其他均為檢測模板(圖1)。

1.2方法

1.2.1DNA提取及檢測 DNA提取技術(shù)采用CTAB法從小葉錦雞兒種子中進行提取[15]，用1%瓊脂糖電泳檢測其質(zhì)量，用UNICO UV-2000型分光光度計檢測其濃度，所有DNA樣品稀釋到50 ng/μL。

1.2.2反應(yīng)體系優(yōu)化 針對模板DNA、Mg2+、dNTP、引物、Taq酶等5種影響因素進行L16(45)正交實驗(表1和表2)。引物為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草資源研究室開發(fā)的“S1-25”(待發(fā)表)，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性45 s，65℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，10個循環(huán)，每循環(huán)的復(fù)性溫度遞減1℃；94℃變性45 s，55℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存[16]。PCR擴增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺分離及銀染檢測[17]。

1.2.3優(yōu)化體系的最終確定 在正交試驗的基礎(chǔ)上又做了Mg2+和Taq DNA聚合酶的四水平完全正交試驗，以確定最佳的反應(yīng)體系，其設(shè)計見表3和表4。結(jié)果用1%瓊脂糖電泳檢測。

圖1 小葉錦雞兒種子DNA電泳圖

表1 SSR-PCR體系的正交設(shè)計因素及水平

表2 SSR-PCR體系正交試驗設(shè)計[L16(45)]

表3 Mg2+和Taq DNA 聚合酶的四水平

表4 Mg2+和Taq DNA聚合酶完全正交設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1DNA提取質(zhì)量 用CTAB法提取的小葉錦雞兒基因組DNA完整，無降解，且無RNA殘留。用紫外分光光度計檢測，OD260/OD280值符合SSR分子標記的要求(圖1)。

2.2SSR-PCR正交設(shè)計結(jié)果及分析 根據(jù)SSR-PCR正交試驗結(jié)果(圖2)可以清晰地看出，這16個組合中，7、8兩組條帶清晰明亮且沒有雜帶，而這兩組只有DNA的量是相同的，所以要確定其他影響因素的量還要經(jīng)過進一步的分析。依據(jù)前人研究[18]可知，引物與模板結(jié)合后在Taq酶作用下進行延伸，Taq DNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，受Mg2+濃度的影響，而Mg2+又受dNTP的拮抗作用。所以，現(xiàn)在只需將dNTP與引物的量固定，設(shè)計Mg2+與Taq酶的完全正交試驗即可得到最佳的優(yōu)化體系。出于成本考慮，本試驗選擇dNTP水平較低的第8組合作為基礎(chǔ)。從Mg2+與Taq酶的完全正交試驗結(jié)果可以看出(圖3)，Taq酶的量對體系影響不顯著，而Mg2+的量對體系影響十分顯著。因表4第15組合與表2第8組合完全相同，所以可以確定條帶最亮的第12組合為最佳體系，即：40 ng模板DNA，3 mmol/L Mg2+，300 μmol/L dNTP，0.6 μmol/L引物，1 U DNA聚合酶，1×Buffer，加dd H2O至25 μL。

圖2 SSR-PCR正交設(shè)計擴增結(jié)果

圖3 Mg2+和Taq DNA聚合酶完全正交設(shè)計擴增結(jié)果

2.3優(yōu)化體系應(yīng)用 利用優(yōu)化的PCR體系對其余種質(zhì)資源進行擴增，條帶清晰明亮且特異性強(圖4)，證明此體系具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，同時也表明小葉錦雞兒種質(zhì)資源具有較高的遺傳多樣性，可以應(yīng)用該優(yōu)化體系對其進行多樣性分析研究。應(yīng)用本優(yōu)化體系對自行開發(fā)的其他SSR引物進行PCR篩選，共得到有效擴增引物37對，根據(jù)其多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC)可知，多態(tài)性引物21對(56.8%)(其部分結(jié)果見圖5)，證明此體系也具有較好的廣泛應(yīng)用性。

圖4 優(yōu)化體系對所有小葉錦雞兒種質(zhì)資源的擴增結(jié)果

圖5 引物S1-13對所有小葉錦雞兒種質(zhì)資源的擴增結(jié)果

3 討論

隨著分子標記技術(shù)的不斷發(fā)展完善，SSR標記也因具有很多優(yōu)良特性而被廣泛應(yīng)用，尤其是在優(yōu)良牧草上的應(yīng)用將更加深入。因影響SSR-PCR的因素很多，且各個因素相互影響[18]，所以應(yīng)用正交設(shè)計這一實用工具將大大提高工作效率。通過本研究優(yōu)化出的擴增體系表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和廣泛性，可為今后的科研工作提供參考。

本研究表明，Mg2+的濃度對SSR-PCR體系的影響十分明顯，這與前人的結(jié)論一致[19]，因此在本研究中參照張麗芳等[20]SSR優(yōu)化方法再設(shè)計一組二因素四水平完全隨機試驗，逐個優(yōu)化其他反應(yīng)成分以確定最佳的反應(yīng)組合。本次SSR-PCR體系的優(yōu)化從更多方面進行開展，能為今后的科研工作提供幫助。但還有些不足，如PCR儀的不同對體系的影響，聚丙烯酰胺凝膠的濃度對產(chǎn)物的分離效率及不同的點樣量對分離效果的影響等問題還有待進一步研究。

本研究所選的PCR程序為Gharghani等[16]的程序，而這一類型的程序在不同的物種當中已有廣泛的應(yīng)用，如韓香婷[21]、曹永國[22]、Tang等[23]分別在大白菜(Brassicapekinensis)、玉米(Zeamays)及資源冷杉(Abiesziyuanensis)中都應(yīng)用此類程序完成了SSR分子標記工作。該程序的優(yōu)點是不改變?nèi)魏螀?shù)即可將不同引物進行擴增，大大節(jié)省了退火溫度的檢測時間和成本。該類程序可為今后的SSR標記工作提供幫助。

依據(jù)優(yōu)化的PCR體系對所設(shè)計的SSR引物進行篩選，結(jié)果有5對(11.63%)得到擴增，但沒有一致性，也與目的片段相差很大，有1對(2.32%)沒有擴增產(chǎn)物，其原因可能為設(shè)計引物時所選用的序列為基因突變的片段，另外也有可能是測序過程中的堿基錯誤影響了引物設(shè)計，進而影響了PCR擴增。本研究共得到多態(tài)性引物21對，其余引物也可能存在多態(tài)性，只是因為用于檢測的個體數(shù)較少而沒有表現(xiàn)出多態(tài)性，這些引物的多態(tài)性檢測將在今后的工作中進行。

4 結(jié)論

1)采用正交設(shè)計和完全正交試驗優(yōu)化了小葉錦雞兒SSR-PCR反應(yīng)體系，其最適的反應(yīng)體系為(25 μL)：40 ng模板DNA，3 mmol/L Mg2+，300 μmol/L dNTP，0.6 μmol/L引物，1 U Taq DNA聚合酶，1×Buffer。

2)利用上述優(yōu)化體系對小葉錦雞兒種質(zhì)資源進行檢測，證明該體系具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性；應(yīng)用該體系對自行開發(fā)的SSR引物進行篩選，得到有效擴增引物37對，其中多態(tài)性引物21對，占56.8%，證明該體系具有廣泛的應(yīng)用性。

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