任蓓蕾 史小莉 閆世梁 崔鳳霞

（鄭州拓洋實業(yè)有限公司技術中心，河南 鄭州 450066）

D-核糖（D-Ribose，D-R）是一種具有重要生理意義的五碳糖，廣泛應用于食品及醫(yī)藥工業(yè)，是目前合成維生素B2的重要原料，也可用于合成抗病毒、抗腫瘤的藥物[1]。它的生產方法主要有三種，一是抽提法，二是化學合成法，三是生物發(fā)酵法。前兩種因其產率低、成本高、環(huán)境污染大等諸多問題，在規(guī)?；a中基本上被淘汰，而生物發(fā)酵法是葡萄糖利用微生物發(fā)酵生產，因其成本低、易于大規(guī)模生產、環(huán)境污染較小等優(yōu)點[2],已得到國內外D-核糖生產廠家的普遍采用。D-核糖發(fā)酵是磷酸戊糖途徑(I-IMP)的非氧化支路缺失，使微生物改變酶系，積累阻斷反應的前體來進行代謝控制發(fā)酵的[3]，但D-核糖產生菌--枯草芽孢桿菌轉酮醇酶變異株常常會受到噬菌體的污染而使生產受到影響，抗噬菌體菌株的選育是發(fā)酵工業(yè)噬菌體防治的重要方法之一。國外已將菌株的抗噬菌體特性作為評價或篩選發(fā)酵劑優(yōu)良菌株的重要標準[4]。為此，我們從D-核糖的異常發(fā)酵液中分離純化了噬菌體并開展了抗噬菌體菌株的選育工作，本文報道了此項研究結果。

1 材料和方法

1.1 材料。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）轉酮醇酶（Transketolase）變異株 XB02，本公司自備。

噬菌體P001，本公司異常發(fā)酵液中分離純化而得。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 肉湯培養(yǎng)基

牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、可溶性淀粉2.0%、NaC1 0.5%、酵母膏0.1%，pH值7.0-7.2，加入瓊脂2.0%則為固體培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基用于細菌和噬菌體的保藏、擴增及活化等。

1.2.2 噬菌體培養(yǎng)基

上層培養(yǎng)基配比：淀粉1%，精解蛋白胨0.2%，NaC1 0.1%，NaNO30.1%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.001%，瓊脂 1%，pH 7.8-8.0；

下層培養(yǎng)基配比：牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%，NaC1 0.5%，瓊脂2.0%，pH 7.4-7.5。

1.2.3 種子培養(yǎng)基

葡萄糖2.0%、酵母膏0.35%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%，pH7.0-7.2。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖20%、玉米漿3%、(NH4)2SO40.6%、CaCO3 3.6%、MnSO4·4H2O 0.005%。pH 7.0-7.2。

1.3 培養(yǎng)方法

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敏感菌株、抗性菌株及噬菌體在肉湯培養(yǎng)基或雙層瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)溫度為35±0.5℃，培養(yǎng)時間為24h。噬菌體原液的制備、搖瓶種子培養(yǎng)及發(fā)酵均在旋轉式搖床上進行，培養(yǎng)溫度為 35±0.5℃，轉速 220rpm，培養(yǎng)周期分別為24、20和72h。

50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件：溫度為35±0.5℃，罐壓為 0.1Mpa，攪拌轉速為 400rpm，通氣量為 1：0.5v/v/m。

1.4 噬菌體的分離純化、原液制備及效價測定

取D-核糖異常發(fā)酵液4000r/min離心20min。上清液經微孔濾膜過濾除菌得到含有噬菌體的樣液，然后在雙層瓊脂平板上進行噬菌體的分離。噬菌體的分離、純化及原液制備參照文獻[5，6]。噬菌體效價測定采用雙層平板法[7]。

1.5 抗噬菌體菌株的選育方法

1.5.1 抗噬菌體菌株的篩選

抗噬菌體菌株的選育方法采用紫外線誘變法。從活化好的敏感菌斜面中刮出菌苔，制成單細胞懸浮液。在直徑6cm的培養(yǎng)皿中加入3mL單細胞懸浮液，放人暗箱并用電磁攪拌器進行攪拌，在l5w紫外燈下距離（20cm 、25cm）照射(15、20、25s)(紫外燈先預熱 20min，使其波長穩(wěn)定)。黑暗中靜置30min后，取菌懸液1mL接入種子培養(yǎng)基中，同時加入噬菌體液1mL(108pfu/m1)，搖床振蕩培養(yǎng)24h后取培養(yǎng)液進行適當稀釋，將其涂布于肉湯培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，挑取單菌落用劃線點滴法[8]測定其對噬菌體的抗性，同時對其進行鏡檢，挑選出既具有抗性又與出發(fā)菌株相似的菌株。將這些菌株分別接入種子培養(yǎng)基中，同時加入噬菌體混合培養(yǎng)。比較上述菌株在搖瓶發(fā)酵中的產D-核糖能力，最后選出既有穩(wěn)定抗性又高產的菌株作為目的菌株。

1.5.2 抗性菌株遺傳穩(wěn)定性試驗

將選育獲得的抗性菌株分別含噬菌體的液體種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基進行連續(xù)傳代。每次傳代后用雙層瓊脂法、35±0.5℃培養(yǎng)48h做抗性檢查。在低倍鏡下觀察是否出現噬菌斑。

1.6 測定方法

D-核糖含量的檢測采用苔黑酚法[9]。菌體生長量(OD值)的測定：用蒸餾水稀釋發(fā)酵液10倍，以蒸餾水作空白，用721分光光度計測定發(fā)酵液在590nm處的光密度。

2 結果與討論

2.1 噬菌體的分離純化和濃縮

經多次分離、純化，從D-核糖的異常發(fā)酵液中獲得了一種噬菌體，將其命名為P001，它在雙層瓊脂平板上可產生一種形態(tài)基本一致的噬菌斑。P001的噬菌體為透明的邊緣清晰的圓形噬菌斑，直徑約2.4mm左右。將純化后的噬菌體加入已接菌的種子培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，可以得到效價達1000pfu/mL以上的噬菌體原液。

2.2 抗噬菌體菌株的選育

以枯草芽孢桿菌轉酮醇酶變異株XB02為出發(fā)菌株，經紫外線誘變法誘變，得出最佳誘變工作參數為：采用15W紫外燈 (預熱20min)下，距離25cm照射25S。獲得了16株對噬菌體P001具有抗性的變異菌株，挑選出生長正常產D-核糖能力、生長狀況與出發(fā)菌株相近的菌株5株。經多次復篩獲得了2株抗噬菌體的D-核糖高產菌株Kp03、Kp14。菌株Kp03、Kp14在噬菌體存在的條件下產D-核糖水平達到了對照敏感株的正常產D-核糖水平（如表1）。

2.3 菌株Kp03、Kp14抗噬菌體能力的檢測

將菌株Kp03、Kp14及敏感株XB02分別接入混有0.2 mL噬菌體原液（效價1000pfu/mL）的種子液中進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。在整個培養(yǎng)過程中，敏感菌株XB02的生長受到明顯抑制，并產生大量的噬菌體，培養(yǎng)液中噬菌體的濃度最高可達1005pfu/mL以上。而抗株Kp03、Kp14表現正常，對試驗濃度下的噬菌體P001具有明顯的抗性。

2.4 抗噬菌體菌株的遺傳穩(wěn)定性

在噬菌體P001存在的條件下。對抗株Kp03、Kp14進行搖瓶種子培養(yǎng)和發(fā)酵試驗，考察了多次傳代后抗株的種液OD值及發(fā)酵產D-核糖能力；結果表明抗株Kp03在種子培養(yǎng)及發(fā)酵中出現異?，F象，遺傳穩(wěn)定性差。而抗株Kp14在種子培養(yǎng)及發(fā)酵過程中均未出現抗性改變的現象，具有較好的遺傳穩(wěn)定性，鏡檢也未發(fā)現異常情況。

2.5 抗噬菌體菌株的發(fā)酵性能測定

按敏感菌株XB02的發(fā)酵條件，在生產環(huán)境中噬菌體大量存在的情況下，在50 L的發(fā)酵罐上對抗株Kp14進行了連續(xù)5批次的發(fā)酵試驗(表2)。結果表明，在發(fā)酵過程中，抗株Kp14與敏感株XB02的正常發(fā)酵大致相同，未出現受噬菌體污染的跡象。從產D-核糖能力上看，抗株Kp14這5批次的平均發(fā)酵轉化率達到了50.61%，平均D-核糖產量達91.48 g/L，平均發(fā)酵周期52 h，與未受噬菌體污染的敏感株XB02基本相當。

結論

本文對D-核糖產生菌--枯草芽孢桿菌轉酮醇酶變異株XB02抗噬菌體菌株的選育進行了研究，通過紫外誘變得到了遺傳特性穩(wěn)定、發(fā)酵性能與出發(fā)菌株相似的抗株Kp14。但要把該抗株放心地用于工業(yè)生產，還要對它的最適發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵的工藝條件等進行進一步的研究。

[1]邱蔚然,高淑紅.發(fā)酵法生產 D-核糖[J].工業(yè)微生物，2003，30(1)：58-64.

[2]Sasajima K，Yoneda M.Carbohydrate metabolism-mutants of a Bacillus species part II.D -ribose accumulation by pentose phosphate pathway mutants[J].Agr Biol Chem，1971，35(4)：509-517.

[3]王樹慶，張詠梅，張克旭.D-核糖高產菌株的選育[J].工業(yè)微生物，2OO2，32(2)～22-25.

[4]呂加平,于景華,駱承庠.乳酸菌發(fā)酵劑優(yōu)良菌種的選育 [J]中國乳品工業(yè) ，2002，30(5)：49-53.

[5]余茂劾,司揮東.噬菌體實驗技術[M].北京：科學出版社.1991.

[6]LU Z，BREIDT F J，FLEM IN G H P，et a1.Isolation and Characterization of a Lactobacillus Plantarum Bacteriophage,L-1，from a Cucumber Fermentation [J].IntemationalJournal ofFood Microbiology，2003(84)：225-235.

[7]范秀容,沈 萍.微生物學實驗[M].北京：高等教育出版社.1988：l02.

[8]余茂效，那淑敏，董扣洪，等.抗噬菌體產a-淀粉酶菌株的選育 [J].微生物學報，1986，26(3)：232.237.

[9]彭其安，張西峰，吳思方，等.同源重組法構建枯草芽孢桿菌轉酮酶缺失突變菌株 [J].生物技術，2006，16(6)：23-16.