劉史佳，劉子修，周 玲，居文政，張 軍，談恒山

(南京中醫(yī)藥大學(xué)1.附屬醫(yī)院臨床藥理科、2.藥學(xué)院，江蘇 南京 210029;3.南京軍區(qū)總醫(yī)院，江蘇南京 210002)

雷公藤(Tripterygium wilfordiiHook.)為衛(wèi)矛科植物雷公藤的根、葉及花。其味辛苦，藥性溫涼，入肝、脾二經(jīng)、通十二經(jīng)絡(luò)，其皮有毒，藥用其蕊。雷公藤具有清熱解毒、祛風(fēng)通絡(luò)、舒筋活血、消腫止痛、殺蟲止血等功效。雷公藤在臨床上效果明顯，但是大量研究表明其臨床上的毒副作用不容小視，由于其治療窗較窄，低濃度時(shí)起到治療作用，體內(nèi)濃度較高時(shí)會(huì)引起毒副作用。如何在不影響其療效的基礎(chǔ)上降低或者消除其毒性，一直是研究人員廣為關(guān)注的重要問題［1］。

有關(guān)中藥安全性的問題報(bào)道日益增多，藥物誘導(dǎo)或抑制CYP450導(dǎo)致的藥物間的相互作用已經(jīng)引起了醫(yī)藥界的關(guān)注。“Cocktail”探針?biāo)幬锓ㄒ蚱鋸?qiáng)大的分析能力和廣泛的適用性而被成功的應(yīng)用。它是鑒定藥物間是否存在著相互作用的有效的方法［2］。

已有國外文獻(xiàn)報(bào)道［3］，在體外試驗(yàn)表明雷公藤內(nèi)酯醇在人體和大鼠肝微粒體中的代謝與CYP3A4和CYP2C19酶有關(guān)，其中CYP3A4是其主要的羥基化代謝酶。因此從藥物代謝的角度出發(fā)，采用液質(zhì)聯(lián)用儀同時(shí)測定咪達(dá)唑侖和奧美拉唑在大鼠體內(nèi)的濃度［4-6］，通過“Cocktail”探針?biāo)幬锇ㄟ溥_(dá)唑侖(midazolam)CYP3A4、奧美拉唑(chlorzoxazone)CYP2C19這2種探針?biāo)幬锏拇x變化進(jìn)一步確證在大鼠體內(nèi)雷公藤片對(duì)P450酶活性的影響，對(duì)于那些有多重代謝途徑的藥物的劑量設(shè)計(jì)有極為重要的指導(dǎo)意義。降低和避免在臨床應(yīng)用聯(lián)合用藥時(shí)由于藥物相互作用而產(chǎn)生的毒副作用。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑雷公藤片(三九黃石制藥廠，批號(hào):090604，規(guī)格:100 mg/片，每片含雷公藤甲素33 μg)，注射用奧美拉唑鈉(常州四藥制藥有限公司，批號(hào):20100414D1，規(guī)格:40 mg/支)，咪達(dá)唑侖注射液(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):20100110，規(guī)格:1ml:5mg)，奧美拉唑?qū)φ掌?中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):100367-200702)，咪達(dá)唑侖對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):171250-200401)，替硝唑?qū)φ掌?中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):100338-200502)，甲醇、乙腈為色譜純(Merck Company)，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2儀器Waters Quattro Micro液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Waters公司)，色譜工作站:Masslynx 4.1;Labconco離心濃縮儀(美國照生公司);梅特勒 -托利多AE240電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司);Biofuge PrimoR冷凍高速離心機(jī)(德國Heraeus公司);Millipore Drict-Q5超純水機(jī)(法國Millipore公司);WH-2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)。

1.3動(dòng)物及給藥方法SD♂大鼠，體質(zhì)量(260±30)g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXX(滬)2009-0008。動(dòng)物隨機(jī)分為低劑量和高劑量兩組，每組8只。給藥劑量為:低劑量組40 mg·kg-1，高劑量組80 mg·kg-1。將雷公藤片研磨成粉末，加少量纖維素鈉制成混懸液灌胃，兩組大鼠每天早晚灌胃雷公藤混懸液2次，連續(xù)給藥10 d。在給雷公藤混懸液前，兩組大鼠均給予Cocktail探針?biāo)幬镞溥_(dá)唑侖、奧美拉唑，分別按30、50 mg·kg-1的劑量。在兩組大鼠連續(xù)灌胃雷公藤混懸液10 d后，于次日早晨再次進(jìn)行探針?biāo)幬锝o藥，兩組大鼠的給藥劑量，取血時(shí)間均和給雷公藤混懸液前相同。

1.4血樣采集與處理在給大鼠探針?biāo)幬锴凹敖o藥后的 5，10，20，30，45，60，90，120，150，180，240 和360 min由眼眶靜脈取血約0.4 ml。置肝素抗凝試管，離心，分離血漿存于-75℃待測。精密取血漿樣品 100 μl，加入內(nèi)標(biāo)溶液(5 000 μg·L-1替硝唑甲醇溶液)10 μl，旋渦 30 s 混勻，加入 800 μl乙酸乙酯，旋渦 3 min，于 4℃ 12 000 r·min-1離心10 min，吸取上層溶液700 μl，放置于離心濃縮儀45℃至干，用 100 μl體積分?jǐn)?shù)為 0.7 的甲醇溶解，10 μl進(jìn)樣分析。

1.5色譜條件色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm)(美國 Agilent公司);保護(hù)柱:Agilent Zorbax SB-C18(12.5 mm × 4.6 mm，5 μm)(美國Agilent公司);流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)為0.001的甲酸(A液)∶甲醇(B液)=25∶75，流速:0.2 ml·min-1;柱溫:30℃。

1.6質(zhì)譜檢測條件離子化方式為電噴霧(ESI);多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);檢測離子為正離子。咪達(dá)唑侖為［M+H］+，m/z=326.2→291.2;奧美拉唑?yàn)椋跰+H］+，m/z=364.2→136.1;替硝唑?yàn)椋跰+H］+，m/z=248.2→121.0。檢測電壓:3.5 kV;錐孔電壓:50 V;離子源溫度:110℃;脫溶劑溫度:350℃;脫溶劑氣體流速:450 L·h-1;碰撞氣能量:20 EV［5］。

1.7血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取空白血漿100 μl，加入內(nèi)標(biāo)液(5 000 μg·L-1替硝唑?qū)φ掌?10 μl，再加入2種探針?biāo)幬?，使血漿中咪達(dá)唑侖、奧美拉唑的濃度分別為 1、5、10、50、100、500、1 000、5 000、1 ×104μg·L-1，按血漿樣品處理方法處理。

1.8數(shù)據(jù)處理運(yùn)用藥動(dòng)學(xué)專用軟件DAS 2.0計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。給藥前后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的差異用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)，顯著性檢驗(yàn)采用兩階段交叉設(shè)計(jì)資料的方差分析。

2 結(jié)果

2.1色譜行為本色譜條件下，咪達(dá)唑侖保留時(shí)間在3.3 min左右，奧美拉唑保留時(shí)間在2.9 min左右，替硝唑(內(nèi)標(biāo))保留時(shí)間在2.2 min左右。2種探針?biāo)幬锱c內(nèi)標(biāo)分離良好，無雜峰干擾測定，基線平穩(wěn)(見Fig 1)。本方法具有較高的特異性，能準(zhǔn)確測定血漿中的咪達(dá)唑侖、奧美拉唑的濃度，重現(xiàn)性好。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線所測結(jié)果，將探針?biāo)幬锖蛢?nèi)標(biāo)的峰面積比值對(duì)探針?biāo)幬锏牧繚舛冗M(jìn)行線性回歸，得回歸方程，咪達(dá)唑侖:^Y=0.03934X+0.01493，r=0.9987;奧美拉唑:^Y=0.01165X-0.00464，r=0.9991。

Fig 1 Chromatograms of the assay

2.3精密度與提取回收率考察日內(nèi)精密度與日間精密度。按標(biāo)準(zhǔn)曲線配制方法制備含咪達(dá)唑侖和奧美拉唑的低、中、高 3 種(2、800、8 000 μg·L-1)濃度的含藥血漿，每種濃度作5份樣品，記錄峰高比值(f)。根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線求得精密度，結(jié)果表明日內(nèi)精密度與日間精密度均小于12%。同時(shí)測得探針?biāo)幬锏奶崛』厥章史謩e為:咪達(dá)唑侖(83.1±6.2)%，奧美拉唑(80.9±5.6)%。

2.4樣品穩(wěn)定性考察本實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了2種探針?biāo)幬镌诓煌４鏃l件下的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖和奧美拉唑的血漿樣品在-20℃冰箱內(nèi)冷凍保存，7 d內(nèi)樣品穩(wěn)定。標(biāo)準(zhǔn)品在甲醇中4℃下，可保存兩個(gè)月以上，血漿樣品在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。血漿樣品反復(fù)凍融2次后測定結(jié)果穩(wěn)定。

2.5藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

2.5.12種探針?biāo)幬锏乃?時(shí)曲線 大鼠灌胃雷公藤片前、后灌胃Cocktail探針?biāo)幬铮础?.6”項(xiàng)方法操作，測得2種探針?biāo)幬锏难帩舛龋Y(jié)果見Fig 2。

Fig 2 Pharmacokinetic profile of probe drugs in plasma

2.5.22種探針?biāo)幬锼巹?dòng)學(xué)參數(shù) 咪達(dá)唑侖、奧美拉唑藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)中國藥理學(xué)會(huì)推薦的DAS 2.0程序處理，分別按單室、二室、三室模型以最小二乘法擬合后，咪達(dá)唑侖、奧美拉唑符合二室模型，權(quán)重為1/C/C。2種探針?biāo)幍纳锇胨テ?、表觀分布容積(Vd/F)、機(jī)體總清除率(CL/F)、藥時(shí)曲線下面積(AUC)、達(dá)峰時(shí)間(Tmax)、最大血藥濃度(Cmax)，低劑量組見Tab 2;高劑量組見Tab 3。

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of two probe drugs after low dosing of Tripterygium wilfordii tablets in rats(n=8)

Tab 3 Pharmacokinetic parameters of tow probe drugs after high dosing of Tripterygium wilfordii tablets in rats(n=8)

3 討論

連續(xù)灌胃雷公藤片10 d后，低劑量組和高劑量組中咪達(dá)唑侖的AUC明顯增加，CL/F明顯降低，增大，Vd/F和Tmax變化不明顯，高劑量組中Cmax有所增大;低劑量組中奧美拉唑的和Vd/F有所增大，高劑量組中AUC增加。試驗(yàn)結(jié)果表明，合并用藥10 d后咪達(dá)唑侖在大鼠體內(nèi)濃度增高，代謝減慢，說明雷公藤片對(duì)大鼠體內(nèi)CYP3A4酶具有抑制作用;而CYP2C19酶在體內(nèi)存在較大的多態(tài)性，代謝個(gè)體差異較大［6］，本實(shí)驗(yàn)所得的奧美拉唑的藥代參數(shù)結(jié)果偏差較大，因此我們推測雷公藤片可能對(duì)大鼠體內(nèi)的CYP2C19具有一定的抑制作用。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)雷公藤片與CYP3A4、CYP2C19酶的底物藥物合用時(shí)，需要調(diào)整給藥劑量避免藥物相互作用使體內(nèi)血藥濃度過高產(chǎn)生毒副作用。

近年來，Cocktail探針?biāo)幬锓ㄒ延糜谥兴幍呐R床相互作用研究，已有文獻(xiàn)報(bào)道齊墩果酸［7］、胡黃連苷［8］中藥成分抑制CYP酶活性，以及用Cocktail探針?biāo)幬锓ㄔu(píng)價(jià)連翹［9］對(duì)細(xì)胞色素P450的影響。雷公藤片的主要成分為雷公藤內(nèi)酯醇和雷公藤紅素，成分較復(fù)雜，有效物質(zhì)不明確，給藥代動(dòng)力學(xué)研究帶來困難。根據(jù)中藥多成分和多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，Cocktail探針?biāo)幬锓ㄩ_辟了中藥研究新的思路，為今后的中藥藥理藥效的研究提供了酶學(xué)基礎(chǔ)上的理解和依據(jù)。為聯(lián)合用藥時(shí)給藥方案的制定提供理論依據(jù)。

雷公藤片在臨床應(yīng)用廣泛，具有一定的毒副作用，中西藥合用較多，可能存在潛在的藥物相互作用。有文獻(xiàn)研究表明，體外肝微粒內(nèi)雷公藤內(nèi)酯醇的代謝與CYP3A4和CYP2C19酶有關(guān)［4］。本試驗(yàn)采用“Cocktail”探針?biāo)幬锓ㄟM(jìn)一步驗(yàn)證了雷公藤制劑對(duì)大鼠體內(nèi)這兩種亞型的酶有抑制作用。在臨床合并用藥時(shí)需要調(diào)整給藥劑量避免藥物相互作用使體內(nèi)血藥濃度過高產(chǎn)生毒副作用，從而為臨床安全用藥提供科學(xué)的依據(jù)。

［1］徐央麗.雷公藤的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，17(12):1941-2.

［1］Xu Y L.Research progress of Tripterygium wilfordii［J］.Mod J Integr Trad Chin West Med，2008，17(12):1941-2.

［2］劉 穎，焦建杰，婁建石.“Cocktail”探針?biāo)幬锓ǖ难芯窟M(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)與治療學(xué)雜志，2006，11(11):1225-9.

［2］Liu Y，Jiao J J，Lou J S.Progress of“Cocktail”probe substrates approaches［J］.Chin J Clin Pharmacol Ther，2006，11(11):1225-9.

［3］Li W，Liu Y，He Y Y，et al.Characterization of triptolide hydroxylation by cytochrome P450 in human and rat liver microsomes［J］.Xenobiotica，2008，38(12):1551-65.

［4］毛桂福，郭 濤，夏東亞.咪達(dá)唑侖片在中國回族、朝鮮族和漢族受試者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)比較［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(12):1666-9.

［4］Mao G F，Guo T，Xia D Y.Comparation of pharmacokinetics of midazolam tablet in Chinese Hui，Korean and Han healthy subjects［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(12):1666-9.

［5］許 瀟，謝 林，梁 艷，等.LC-MS法同時(shí)測定大鼠血漿中咪達(dá)唑侖、右美沙芬及奧美拉唑的濃度［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37(3):246-50.

［5］Xu X，Xie L，Liang Y，et al.Simultaneous determination of midazolam，dextromethorphan and omeprazole in rat plasma by LC-MS［J］.J China Pharm Univ，2006，37(3):246-50.

［6］付良青，黃 豐，吳德政.奧美拉哇為探針分析中國漢族人群細(xì)胞色素氧化酶CYPZC19表型多態(tài)性［J］.中國新藥雜志，2005，14(4):461-4.

［6］Fu L Q，Hang F，Wu D Z.Analyses of the phenotype polymorphism of cytochrome CYP2C19 in Chinese Han［J］.Chin J New Drugs，2005，14(4):461-4.

［7］杜 瑜，朱榮華，蘇芬麗，等.齊墩果酸對(duì)健康人體CYP1A2，CYP2E1及CYP3A4抑制作用的研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2008，43(4):300-3.

［7］Du Y，Zhu R H，Su F L，et al.Effect of oleanolic acid on CYP1A2，CYP2E1 and CYP3A4 activity in healthy subjects［J］.Chin Pharm J，2008，43(4):300-3.

［8］Xiao Y J，Jiang Z Z，Yao J C，et al.Investigation of picroside II's impacts on the P450 activities using a cocktail method［J］.Chin J Natural Med，2008，6(4):292-7.

［9］閆淑蓮，扈金萍，徐艷霞，張錦楠.Cocktail探針?biāo)幬锿瑫r(shí)評(píng)價(jià)連翹對(duì)肝細(xì)胞色素P450的影響［J］.中國藥學(xué)雜志，2003，38(10):761-3.

［9］Yan S L，Hu J P，Xu Y X，Zhang J N.Simultaneous evaluation of activity of hepatic CYP450 following administration of Fisch Fructus Forsythiaeby Cocktail probe drugs［J］.Chin Pharm J，2003，38(10):761-3.