尹柏雙，李靜姬，呼顯生，崔永鎮(zhèn)，宋 泰

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林吉林132101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱150001）

自由基氧化損傷與奶牛乳房炎關(guān)系的研究

尹柏雙1，李靜姬1，呼顯生1，崔永鎮(zhèn)2，宋 泰1

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林吉林132101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱150001）

研究乳房炎奶牛血清中自由基含量的變化，探討奶牛乳房炎與氧化損傷的關(guān)系。將14頭奶牛分為健康對照組和乳房炎組，分別在泌乳的不同時(shí)期靜脈采血，分離血清，測定血清中活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量和一氧化氮合酶（NOS）活性。結(jié)果表明，患病奶牛血清中ROS、MDA、NO含量極顯著高于對照組（P＜0.01），NOS活性顯著高于對照組（P＜0.05）。結(jié)果提示，患病奶牛血清中自由基含量的增加和活性的升高，可能是乳腺組織損傷的重要原因之一。

奶牛；乳房炎；自由基；氧化損傷

奶牛乳房炎不僅降低產(chǎn)奶量、影響牛乳的品質(zhì)，使乳汁中細(xì)菌超標(biāo)、并呈酒精陽性乳等，而且還會影響牛奶的營養(yǎng)成分和品質(zhì)，有害人體健康［1］。奶牛乳腺組織是體內(nèi)生化反應(yīng)最復(fù)雜的組織之一，也是新陳代謝最旺盛的組織之一。大量泌乳使得乳腺分泌上皮細(xì)胞的代謝率增高，容易產(chǎn)生大量的氧化代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物過量蓄積于細(xì)胞內(nèi)而不能及時(shí)清除，使得細(xì)胞最終老化、凋亡，引起局部炎癥反應(yīng)［1－3］?；?性 氧 （reactive oxygen species，ROS）與DNA、蛋白質(zhì)和多元不飽和脂肪酸（PUFA）作用，造成DNA鏈斷裂和氧化性損傷、蛋白－蛋白交聯(lián)、蛋白－DNA交聯(lián)和脂質(zhì)過氧化，引起生物膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞，生物體氧化損傷［4］，從而引起慢性疾病［5－6］。因此，本試驗(yàn)從自由基氧化方面切入研究血清自由基與奶牛乳房炎的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動物 選擇產(chǎn)奶量、胎次和泌乳期相近，營養(yǎng)中等懷孕黑白花奶牛，健康組（對照組）7只，乳房炎組7只，對照組與乳房炎組飼養(yǎng)管理?xiàng)l件完全相同，吉林市春光奶牛場提供。

1.1.2 主要試劑 活性氧（ROS）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒、一氧化氮（NO）測試盒、一氧化氮合酶（NOS）測試盒，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集與處理 兩個(gè)試驗(yàn)組分別于泌乳后1、7、14、21、28、35 、42d，7個(gè)時(shí)期進(jìn)行頸靜脈采血，室溫下（不超過20℃）自然凝固1h～2h，冰浴30 min，然后3 000r/min離心10min，分離血清，置－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血清自由基的檢測 ROS含量的檢測用化學(xué)比色法；NO含量的檢測用硝酸還原酶法；NOS活性的檢測用化學(xué)比色法；MDA含量的檢測用硫代巴比妥酸法。具體操作方法參照各測試盒說明書。

2 結(jié)果

2.1 奶牛血清活性氧含量的變化

乳房炎組奶牛血清中活性氧含量在泌乳各時(shí)期均顯著升高，與對照組比較，差異極顯著（P＜0.01）（表1）。

2.2 奶牛血清NO含量的變化

乳房炎組奶牛血清NO含量在泌乳各時(shí)期均顯著升高，與對照組比較，差異極顯著 （P＜0.01）（表2）。

2.3 奶牛血清NOS活性的變化

乳房炎組奶牛血清NOS活性在泌乳各時(shí)期均顯著升高，與對照組比較，差異極顯著 （P＜0.01）（表3）。

2.4 奶牛血清MDA含量的變化

乳房炎組奶牛血清MDA含量在泌乳各時(shí)期均顯著升高，與對照組比較，差異顯著 （P＜0.05）（表4）。

表1 奶牛血清活性氧含量的變化Table 1 The change of active oxygen content in serum of dairy cows U/mL

表2 奶牛血清NO含量的變化Table 2 The change of NO content in serum of dairy cows μmol/mL

表3 奶牛血清NOS活性的變化Table 3 The change of NOS activity in serum of dairy cows U/mL

表4 奶牛血清MDA含量的變化Table 4 The change of MDA content in serum of dairy cows μmol/mL

3 討論

自由基是指分子、原子或基團(tuán)中有不配對電子的一類物質(zhì)，因?yàn)樗麄兌季哂醒踉踊蜓醴肿?，故又稱為活性氧或氧自由基（ROS）。其反應(yīng)能力特別強(qiáng)，可以攻擊生物膜和組織的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)［7］。NO也是一種自由基，參與氧自由基相互反應(yīng)生成毒性更強(qiáng)的強(qiáng)氧化劑過氧化亞硝基陰離子（ONOO·）而介導(dǎo)細(xì)胞毒反應(yīng)，因而NO對氧自由基的損傷效應(yīng)起放大作用，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和組織損傷。NOS作為NO合成酶，其活性變化直接調(diào)節(jié)NO生成量及其生物學(xué)效應(yīng)［8］。機(jī)體在代謝過程中產(chǎn)生的活性氧及其他氧自由基能攻擊生物膜磷脂中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并形成脂質(zhì)過氧化物，脂質(zhì)過氧化物在過氧化條件下是不穩(wěn)定的，能分解生成有細(xì)胞毒性的丙二醛（MDA），損傷組織細(xì)胞。

炎癥是機(jī)體受到外界微生物入侵后的一種保護(hù)性反應(yīng)，病原菌一旦侵入乳腺，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞即被動員起來，向乳腺移動，并吞噬這些侵入細(xì)菌。這時(shí)會出現(xiàn)氧消耗急劇增加的“呼吸猝發(fā)”現(xiàn)象，活性氧生成也隨之增加，繼而引發(fā)自由基反應(yīng)，參與殺滅被吞噬的病原菌［9］。由此可見，中性粒細(xì)胞在吞噬細(xì)菌的過程中，細(xì)胞內(nèi)會隨之生成大量的過氧化物質(zhì)。雖然，這些過氧化物質(zhì)也參與殺滅細(xì)菌，但它也會對細(xì)胞和組織帶來損傷，破壞細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)，而且酶促反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基（·OH）可導(dǎo)致溶酶體的溶細(xì)胞作用以及細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用，使炎癥進(jìn)一步加重［10］。正常情況下，機(jī)體的抗氧化能力與不斷產(chǎn)生的氧自由基的氧化能力之間保持著動態(tài)平衡，不會引起組織損傷，若自由基產(chǎn)生異常增多或機(jī)體的抗氧化能力下降，將導(dǎo)致組織的氧化損傷，引發(fā)疾?。?1］。研究報(bào)道，心肌炎患者血清中內(nèi)源性NO、MDA過量產(chǎn)生［12］；潰瘍性結(jié)腸炎患者血、腸黏膜中NO明顯增高［13］；狼瘡性腎炎患者血中 NO、MDA明顯增高［14］；肝炎、肝硬化患者自由基的水平有明顯升高［15－16］；還有報(bào)道腎小球腎炎的發(fā)病機(jī)理與自由基代謝紊亂有一定關(guān)系［17－18］；以上研究結(jié)果表明自由基產(chǎn)生過量蓄積與疾病的發(fā)生有一定的關(guān)系。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，乳房炎奶牛血清中ROS含量、NO含量和MDA含量極顯著高于對照組，表明乳房炎奶牛機(jī)體存在自由基蓄積，并處于過氧化狀態(tài)。這可能是由于奶牛乳腺受到感染，產(chǎn)生炎癥時(shí)，中性粒細(xì)胞、吞噬細(xì)胞匯集到乳腺吞食入侵細(xì)菌，出現(xiàn)氧消耗劇增，活性氧生成增加，同時(shí)一氧化氮合酶活性增加催化NO大量生成，由于代謝過程中產(chǎn)生的大量活性氧和活性氮能夠攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，形成脂質(zhì)過氧化物及其分解產(chǎn)物MDA，導(dǎo)致機(jī)體及其乳腺組織細(xì)胞受到一定氧化損傷。本試驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果提示，乳房炎奶牛乳腺組織受到氧化損傷，自由基參與了乳房炎的發(fā)生過程。

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Study on Relationship Between Free Radical Oxidative Damage and Cow Mastitis

YIN Bai－shuang1，LI Jing－ji1，HU Xian－sheng1，CUI Yong－zhen2，SONG Tai1

（1.CollegeofAnimalMedicine，JilinAgriculureScienceandTechnologyCollege，Jilin，Jilin，132101，China；
2.HarbinVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Harbin，Heilongjiang，150001，China）

The relationship between free radical oxidative damage and cow mastitis was studied by investigating free radical content in serum of mastitis cow.Fourteen cows were divided into control group and mastitis group.The content of ROS，MDA，NO and activity of NOS in serum of mastitis cow were measured by test kits.The results showed that the content of ROS，MDA，NO in serum were obviously higher as compared with control group（P＜0.01）.The activity of NOS in serum was obviously higher（P＜0.05）.The increasing of content and activity of free radical in serum of mastitis cows possibly is one reason of the damage in mammary gland.

cow；mastitis；free radical；oxidative damage

S852.3

A

1007－5038（2011）10－0050－04

2010－12－17

吉林省教育廳“十一五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（吉科2007232）；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院青年基金項(xiàng)目

尹柏雙（1978－），男，黑龍江哈爾濱人，講師，博士研究生，從事于動物疾病及動物麻醉學(xué)研究。