邢曉旭,劉鐘杰,韓 博

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 100193)

麥角甾苷及松果菊苷對(duì)體外培養(yǎng)大鼠*成骨細(xì)胞BMP2基因表達(dá)的影響

邢曉旭,劉鐘杰*,韓 博

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 100193)

為了觀察麥角甾苷和松果菊苷對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞BMP2基因表達(dá)的影響。本試驗(yàn)采用酶消化法分離得到大鼠顱骨成骨細(xì)胞,在第3代成骨細(xì)胞中分別加入含有不同濃度麥角甾苷和松果菊苷的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),在培養(yǎng)的不同時(shí)間收集細(xì)胞、提取細(xì)胞總RNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法觀察對(duì)成骨細(xì)胞BMP2基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明,麥角甾苷和松果菊苷均能促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞BMP2基因的表達(dá)。

麥角甾苷;松果菊苷;成骨細(xì)胞;BMP2;熒光定量PCR

*通訊作者

隨著社會(huì)老齡化的發(fā)展,骨質(zhì)疏松等老年人常見(jiàn)的骨科疾病越來(lái)越受到人們的關(guān)注。這些常見(jiàn)的骨科疾病不僅影響了人們的健康,也影響了人們的日常生活。因此,如何促進(jìn)骨折愈合、縮短骨折愈合周期和提高愈合質(zhì)量,如何防治骨質(zhì)疏松已成為骨科研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。

根據(jù)中醫(yī)“腎藏精,主骨,生髓”,“髓者,腎精所生,精足則髓足,髓足骨內(nèi),髓足者則骨強(qiáng)”的理論,采用單味補(bǔ)腎中藥治療骨折、骨質(zhì)疏松等骨科疾病在我國(guó)已經(jīng)有很長(zhǎng)的歷史。而肉蓯蓉作為我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)腎中藥在民間已經(jīng)被廣泛應(yīng)用,但是其在促進(jìn)骨愈合、防治骨科疾病機(jī)理方面的研究卻極少。

肉蓯蓉又叫地精、大蕓,是我國(guó)常用的一味補(bǔ)腎中藥,具有“溫而不熱,補(bǔ)而不峻,暖而不燥,滑而不泄”的特點(diǎn)。在肉蓯蓉的各種化學(xué)成分當(dāng)中,麥角甾苷(acteoside)和松果菊苷(echinacoside)是肉蓯蓉主要的兩個(gè)活性成分[1]。有研究表明,在肉蓯蓉中起補(bǔ)腎壯陽(yáng)的有效成分主要是苯乙醇苷類化合物[1],而麥角甾苷和松果菊苷就是苯乙醇苷類中兩個(gè)主要成分[2]。

松果菊苷具有很廣泛的藥理作用,具有抗氧化、保護(hù)神經(jīng)、抗炎、保護(hù)肝臟、改善學(xué)習(xí)記憶和免疫調(diào)節(jié)的作用[3]。而肉蓯蓉中的麥角甾苷,則具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖,提高機(jī)體非特異性細(xì)胞免疫和免疫調(diào)節(jié),從而增強(qiáng)免疫的功能[1]。但是對(duì)其在促進(jìn)骨形成方面的研究卻很少涉及。

因此,本試驗(yàn)通過(guò)研究中藥肉蓯蓉的兩個(gè)主要活性成分—麥角甾苷和松果菊苷對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞BMP2基因表達(dá)的影響,從而來(lái)探討補(bǔ)腎中藥肉蓯蓉在加速骨折愈合,防治骨質(zhì)疏松等骨科疾病方面的機(jī)理,為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物 麥角甾苷和松果菊苷購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.1.2 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);Ⅱ型膠原酶(Sigma公司);T rizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、P EASY-T3Cloning Kit連接試劑盒(TransGen Biotech);Gel Extraction Kit膠回收試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);BMP2、內(nèi)參β-actin的PCR引物(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成);SYBR Green(TIANGEN Biotech);7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems)

1.2 方法

1.2.1 大鼠成骨細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 取10只出生24 h的大鼠乳鼠,脫頸椎處死后,采用酶消化法分離收集大鼠成骨細(xì)胞,用含150 mL/L FBS的DMEM完全培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液,待細(xì)胞80%匯合時(shí)傳代。培養(yǎng)的細(xì)胞采用瑞氏染色觀察、堿性磷酸酶和茜素紅鈣化染色進(jìn)行鑒定。

1.2.2 試驗(yàn)分組 取第三代成骨細(xì)胞,以105的密度接種于六孔板中,隨機(jī)分成試驗(yàn)組和空白組,每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。細(xì)胞貼壁后,經(jīng) 40 mL/L FBS的DMEM維持培養(yǎng)基處理24 h后。對(duì)照組分別加入含有不同濃度的麥角甾苷和松果菊苷的培養(yǎng)液。麥角甾苷的濃度為 1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6mg/mL作為試驗(yàn)組,松果菊苷的濃度為 5×10-4、5×10-5、5 ×10-6、5 ×10-7、5×10-8mg/mL作為試驗(yàn)組。對(duì)照組為不含藥液的培養(yǎng)液,然后分別于24、48、72 h收集細(xì)胞。

1.2.3 總RNA的提取和cDNA的合成 采用T rizol法進(jìn)行大鼠成骨細(xì)胞總RNA提取。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明對(duì)提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。通過(guò)參考GenBank上大鼠BMP2和β-actin的基因序列以及已發(fā)表的文獻(xiàn)[2,3],由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成兩對(duì)特異性引物(引物序列見(jiàn)表1)。

表1 大鼠成骨細(xì)胞BMP2和β-actin引物序列Table 1 Sequence of primers for BMP2 and β-actin for rat osteoblast

1.2.4 基因的克隆 PCR反應(yīng)后,將β-actin和BMP2的目的基因經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行純化回收,經(jīng)載體連接后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)藍(lán)白斑選擇后,挑取陽(yáng)性菌落克隆培養(yǎng)。并將陽(yáng)性菌液送到北京華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序后將β-actin和BMP2的序列分別在GenBank中進(jìn)行比對(duì)。將經(jīng)過(guò)測(cè)序的菌液進(jìn)行質(zhì)粒純化回收。

1.2.5 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建和樣品中基因的檢測(cè) β-actin和BMP2標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋后作為模板來(lái)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建。將經(jīng)不同濃度藥物處理的成骨細(xì)胞cDNA作為模板,采用熒光定量PCR的方法對(duì)樣品中的目的基因進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 為了糾正逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)效率的差異對(duì)結(jié)果的影響,最終結(jié)果用BMP2/β-actin的比值來(lái)表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,單因素方差分析組間差異性比較。

2 結(jié)果

2.1 大鼠成骨細(xì)胞的鑒定

培養(yǎng)48 h的細(xì)胞經(jīng)瑞氏染色后(圖1A),可觀察到細(xì)胞呈三角形或多角形,胞質(zhì)透明顆粒較少,胞核呈卵圓形,具有典型的成骨細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞培養(yǎng)48 h經(jīng)堿性磷酸酶染色(圖1B),可看到細(xì)胞有黑色顆粒或塊狀沉淀,表明細(xì)胞的胞漿中富含有堿性磷酸酶。細(xì)胞培養(yǎng)21 d后,經(jīng)茜素紅染色,可見(jiàn)有紅色礦化結(jié)節(jié)(圖1C),以上特點(diǎn)均符合成骨細(xì)胞的特性。通過(guò)以上方法可以證明試驗(yàn)中分離的細(xì)胞是成骨細(xì)胞。

圖1 體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞的鑒定Fig.1 T he identification of rat osteoblast vitro culture

2.2 麥角甾苷對(duì)大鼠成骨細(xì)胞BMP2基因表達(dá)的影響

用β-actin和BMP2標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋作為模板制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用熒光定量PCR方法對(duì)經(jīng)過(guò)不同濃度和藥物處理的成骨細(xì)胞cDNA中BMP2含量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中可以看出,濃度 1×10-5mg/mL的麥角甾苷與對(duì)照組相比,該濃度對(duì)成骨細(xì)胞BMP2的表達(dá)有顯著的促進(jìn)作用。在作用較長(zhǎng)時(shí)間(72 h)后,各個(gè)濃度的麥角甾苷則呈現(xiàn)較強(qiáng)烈的促進(jìn)作用,與24 h、48 h相比,都能不同程度的促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞BMP2基因的表達(dá)。

表2 不同濃度的麥角甾苷對(duì)大鼠成骨細(xì)胞BMP2/β-actin比值的影響Table 2 The ratio of BM P2 to β-actin mRNA in rat osteoblasts treated with different concentrations of Acteoside

2.3 松果菊苷對(duì)大鼠成骨細(xì)胞BMP2基因表達(dá)的影響

從表 3可以看出,濃度為 5×10-4、5×10-6mg/mL的松果菊苷可以顯著上調(diào)大鼠成骨細(xì)胞BMP2基因的表達(dá),尤其是5×10-6mg/mL對(duì)其具有極其顯著的影響。此外,不同濃度的松果菊苷在72h均可以顯著促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞BMP2基因的表達(dá)。

表3 不同濃度的松果菊苷對(duì)大鼠成骨細(xì)胞BMP2/β-actin比值的影響Table 3 he ratio of BMP2 to β-actin mRN A in rat osteoblasts treated with dif ferent concentrations of Echinacoside

3 討論

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming grow th factorβ,TGF-β)超家族成員。BMP 是一種可溶的、低分子跨膜糖蛋白,是唯一能夠誘導(dǎo)異位成骨的因子,其中BMP2是最主要的骨形成調(diào)控因子,具有最高的成骨活性[4]。在骨形成的早期,BMP2可以使未分化的間質(zhì)細(xì)胞向骨形成中心募集,分化為骨系細(xì)胞。還可使成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞及骨髓的基細(xì)胞也分化成骨系細(xì)胞。此外,BMP2還可以維持成骨細(xì)胞特有的細(xì)胞表型,誘導(dǎo)成骨細(xì)胞標(biāo)志物增高。在局部注射補(bǔ)充BMP2,可在短期內(nèi)達(dá)到預(yù)防骨折的目的,有試驗(yàn)表明BMP2基因的表達(dá)與老年性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病有密切的關(guān)系[5]?，F(xiàn)在隨著人們對(duì)BMP2研究的深入,有關(guān)BMP2在臨床中方面的應(yīng)用也越來(lái)越受到關(guān)注。

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出,麥角甾苷和松果菊苷對(duì)大鼠成骨細(xì)胞表達(dá)BMP2均有促進(jìn)作用。較高濃度的麥角甾苷(1×10-5mg/mL)對(duì)大鼠成骨細(xì)胞表達(dá)BMP2具有顯著的促進(jìn)作用。各個(gè)濃度的麥角甾苷在作用72 h后,其對(duì)BMP2 mRNA的促進(jìn)作用才顯現(xiàn)出來(lái)。松果菊苷對(duì)成骨細(xì)胞表達(dá)BMP2的作用趨勢(shì)與麥角甾苷相類似。較高濃度的松果菊苷(5×10-4、5×10-6mg/mL)或是作用較長(zhǎng)時(shí)間(72 h),其對(duì)大鼠成骨細(xì)胞BMP2基因表達(dá)呈現(xiàn)顯著的促進(jìn)作用。因此,從試驗(yàn)結(jié)果可以說(shuō)明,麥角甾苷和松果菊苷對(duì)大鼠成骨細(xì)胞BMP2基因的表達(dá)具有促進(jìn)作用,很可能是補(bǔ)腎中藥肉蓯蓉在促進(jìn)骨愈合、防治骨質(zhì)疏松癥的機(jī)理之一。也可以說(shuō)明在中藥肉蓯蓉的眾多成分中,麥角甾苷和松果菊苷極可能是其促進(jìn)骨愈合的有效成分,為進(jìn)一步探討中藥肉蓯蓉在治療骨科疾病,防治骨質(zhì)疏松方面提供一定的理論依據(jù),也為中藥臨床用藥提供一定的理論依據(jù)。

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Effects of Acteoside and Echinacoside on the Expression of the BMP2 in Rat Osteoblast

XING Xiao-xu,LIU Zhong-jie,HAN Bo

(College of Veterinary Medicine,China Agricultural University,Beijing,100193,China)

In order to evaluate the effects of Acteoside and Echinacoside on the BMP2 gene expression in rat osteoblasts.Osteoblasts were isolated from calvaria in neonatal rat and were processed by the trypsin and collagenase digestion method.Then the third-generation cultured osteoblasts were exposure to different concentrations of Acteoside and Echinacoside for 24,48and 72hours,respectively.The total RNA was isolated from osteoblasts cultured in the different time and BMP2 gene expression were detected by real-time fluorescent quantitative PCR.The result indicated that Acteoside and Echnacoside could promote the expression of BMP2 gene.

Acteoside;Echnacoside;osteoblast;BMP2;fluorescent quantitative PCR

Q786;S853.72

A

1007-5038(2011)08-0045-04*

2010-01-24

邢曉旭(1983-),女,山西太原人,碩士,主要從事中獸醫(yī)學(xué)研究。