王 麗，周慧芳，張艷軍，邊育紅

馬兜鈴酸為硝基菲類(lèi)有機(jī)酸，主要存在于馬兜鈴科馬兜鈴酸屬、細(xì)辛屬、木通科木通屬等[1]。馬兜鈴酸藥理作用廣泛,有抗感染、抗癌及增強(qiáng)細(xì)胞免疫等功能[2-3]。長(zhǎng)期以來(lái)，含有馬兜鈴酸的中藥材被廣泛應(yīng)用于治療各種疾病。近些年，隨著臨床報(bào)道和實(shí)驗(yàn)研究，馬兜鈴酸的毒性、致癌性和其他毒性作用相繼被發(fā)現(xiàn)[4]。目前有關(guān)馬兜鈴酸毒性的機(jī)制尚不十分清楚[5]，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)大量體外實(shí)驗(yàn)證明其毒性作用可能的機(jī)制。因此，研究馬兜鈴酸的體外檢測(cè)方法，了解其在細(xì)胞培養(yǎng)基中含量變化的特點(diǎn)，將有助于深入研究其毒理機(jī)制，從而為其毒副作用的防治提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜（HPLC）法，準(zhǔn)確測(cè)定了藥物在培養(yǎng)基中不同時(shí)間的含量變化情況，為準(zhǔn)確考察藥物對(duì)于細(xì)胞的毒性作用奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑 馬兜鈴酸A對(duì)照品（天津一方科技有限公司，批號(hào)：200406）；甲醇（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；色譜分析用水（娃哈哈飲用純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（Hyclone公司），其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀 (日本島津);LC-solution色譜工作站 (日本島津);SPD-20A紫外檢測(cè)器（日本島津）；KQ－100A型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；XS204分析天平（METTLER TOLEDO）。

2 方法學(xué)考察

2.1 色譜條件 C18色譜柱(150 nm×4.6 nm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水（含 3%的冰醋酸）（70∶30，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，柱溫30℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的配制 精密稱(chēng)取馬兜鈴酸A對(duì)照品10 mg，以甲醇溶解于100 mL容量瓶中,定容至刻度，即得濃度為0.1 g/L的馬兜鈴酸A對(duì)照品母液。

2.3 培養(yǎng)基樣品預(yù)處理 將細(xì)胞培養(yǎng)基精密取出，加入3倍量甲醇，用渦旋儀渦旋30 s，再用10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液進(jìn)樣。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取馬兜鈴酸A對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，配制成馬兜鈴酸 A 50，25，10，5，2.5，0.5 mg/L的系列溶液，分別進(jìn)行測(cè)定。以峰面積（Y）對(duì)濃度（X）作線性回歸，得線性范圍和回歸方程，見(jiàn)表1，圖 1。

表1 培養(yǎng)基樣品中的線性關(guān)系

圖1 馬兜鈴酸A標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 配制馬兜鈴酸A同一濃度的對(duì)照品溶液，進(jìn)行測(cè)定。每隔1 h測(cè)定1次，測(cè)6次，計(jì)算日內(nèi)精密度；每隔1 d測(cè)定1次，測(cè)6 d，計(jì)算日間精密度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，馬兜鈴酸A培養(yǎng)基中的日內(nèi)、日間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.96%、1.92%，均符合要求。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn) 配制馬兜鈴酸A低、中、高3個(gè)濃度的對(duì)照品溶液，加入200 μL空白培養(yǎng)基，按“培養(yǎng)基樣品預(yù)處理方法”處理樣品，分別進(jìn)行測(cè)定。按照對(duì)照品測(cè)得量和加入量之比計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 培養(yǎng)基樣品中的回收率(s，n=3)

表2 培養(yǎng)基樣品中的回收率(s，n=3)

加入量（μg）測(cè)得量（μg）平均回收率（%）RSD（%）2.5 2.35±0.02 94.01 0.91 10 10.43±0.24 104.34 2.26 50 51.39±0.77 102.78 1.50

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，馬兜鈴酸A的低、中、高3種濃度在培養(yǎng)基中的回收率符合要求。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取馬兜鈴酸A對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，配制成培養(yǎng)基樣品中含馬兜鈴酸A 15 mg/L的溶液，按“培養(yǎng)基樣品預(yù)處理方法”處理樣品，將所配藥液于冰箱中冷藏，分別在 0、1、2、4、8、12、24、36、48、72 h進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品測(cè)得量計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，馬兜鈴酸A樣品在72 h內(nèi)RSD為1.96%，樣品在72 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn) 在2.1項(xiàng)下的色譜條件下，測(cè)定馬兜鈴酸A對(duì)照品、空白培養(yǎng)基及加藥后培養(yǎng)基，色譜圖，見(jiàn)圖2-3。

圖2 空白培養(yǎng)基色譜圖

圖3 加藥后培養(yǎng)基色譜圖

由圖可知馬兜鈴酸A的保留時(shí)間約為4.7 min,空白培養(yǎng)基中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾馬兜鈴酸A在培養(yǎng)基中濃度的分析。

2.9 培養(yǎng)基中不同時(shí)間點(diǎn)樣品含量變化測(cè)定 將馬兜鈴酸A加入含有培養(yǎng)基的6孔板，于37℃,5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別以不同時(shí)間點(diǎn)從含藥6孔板中取出培養(yǎng)基[6]，按“培養(yǎng)基樣品預(yù)處理方法”處理樣品，進(jìn)行測(cè)定。以峰面積計(jì)算馬兜鈴酸A在培養(yǎng)基中不同時(shí)間的藥物濃度。數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，其藥物濃度—時(shí)間曲線見(jiàn)圖4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明馬兜鈴酸A在本實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)條件下72 h內(nèi)含量基本穩(wěn)定。

表3 馬兜鈴酸A在培養(yǎng)基中的濃度數(shù)據(jù)(s，n=3)

表3 馬兜鈴酸A在培養(yǎng)基中的濃度數(shù)據(jù)(s，n=3)

時(shí)間（h）馬兜鈴酸A濃度（mg/L）0 14.06±0.46 13.91±0.50 2 13.79±0.38 6 13.73±0.36 12 13.72±0.35 24 13.68±0.33 36 13.67±0.21 48 13.64±0.33 72 13.59±0.22 1

圖4 馬兜鈴酸A在培養(yǎng)基中的藥-時(shí)曲線

3 討論

在考察培養(yǎng)基樣品預(yù)處理方法時(shí)，比較了不同方法沉淀蛋白（甲醇、高氯酸）及乙醚提取法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高氯酸沉淀蛋白法及乙醚提取法回收率較低，甲醇直接沉淀蛋白法，回收率較高，可以滿(mǎn)足檢測(cè)要求，且操作簡(jiǎn)便快捷，故本實(shí)驗(yàn)采用甲醇作為沉淀試劑。

體外藥理實(shí)驗(yàn)中，通常采用向含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中多次加入一定濃度的藥物以考察其對(duì)細(xì)胞的作用情況。因此，建立藥物在培養(yǎng)基中的測(cè)定方法，搞清其在細(xì)胞培養(yǎng)基中的變化情況，將會(huì)對(duì)體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)具有重要的意義[7]。本實(shí)驗(yàn)采用DMEM培養(yǎng)基（含10%血清），pH約為7.4，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)條件下72 h內(nèi)馬兜鈴酸A在培養(yǎng)基中含量基本穩(wěn)定，這對(duì)于以后實(shí)驗(yàn)中，藥物作用時(shí)間及細(xì)胞換液時(shí)間的選擇具有一定的參考意義。

本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基中馬兜鈴酸A含量的方法，實(shí)驗(yàn)證明，本方法能夠有效地測(cè)定藥物在培養(yǎng)基中含量的變化情況，靈敏度高，重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)便快捷，對(duì)準(zhǔn)確考察馬兜鈴酸A對(duì)細(xì)胞的作用情況有指導(dǎo)意義。

[1]蔣貴仲，陳 靈.中藥中馬兜鈴酸A的毒性研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24（9）：84－87.

[2]陳孟蘭，朱正蘭.馬兜鈴屬植物的藥理作用研究進(jìn)展[J].武漢生物工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，3（1）：59－62.

[3]張萬(wàn)明,馬淑蘭.馬兜鈴酸A及含有馬兜鈴酸A中藥的研究概述[J].河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，23（6）：35－38.

[4]張曉妍.馬兜鈴酸腎病實(shí)驗(yàn)研究近況[J].遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，7（1）：76－77.

[5]許勇芝，陳麗萍，劉華鋒，等.馬兜鈴酸致腎小管上皮細(xì)胞損傷中p53和Caspase-3活性的變化[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30（5）：398－401.

[6]沈岳飛，羅杰峰，莫雪安，等.小鼠胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23（1）：43－45.

[7]李 越，杜 嶸，張艷軍.高效液相色譜法測(cè)定人參皂苷Rg1與黃芩苷在細(xì)胞培養(yǎng)基中的含量變化[J].天津中醫(yī)藥，2006，23（2）：160－162.