黃 科 伍 杰 陳典剛 張永紅 李春峰 周澤揚(yáng)，3

(1.西南大學(xué)蠶學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)研究所，生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716;2.重慶文理學(xué)院花卉研究所，重慶 402160;3.重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331)

蠶絲蛋白主要由絲素和絲膠組成。絲膠蛋白在中部絲腺特異表達(dá)，主要由絲膠1蛋白和絲膠2蛋白組成[1-2]。家蠶絲膠1蛋白由4條不同的mRNA編碼，由同一條mRNA經(jīng)不同的剪切方式形成，其長(zhǎng)度分別為10.5kb、9.0kb、4.0kb和2.8kb[3]。1997年Garel A等比較系統(tǒng)地闡明了家蠶4.0kb絲膠1基因的mRNA序列，在家蠶基因組中絲膠1基因含8個(gè)內(nèi)含子[4]。絲膠2基因也通過(guò)不同的剪切方式形成兩條mRNA編碼絲膠2蛋白[2]。絲膠1蛋白和絲膠2蛋白的表達(dá)受到組織的嚴(yán)格調(diào)控，也受到幼蟲(chóng)發(fā)育時(shí)期的調(diào)控[5]。基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，啟動(dòng)子是關(guān)鍵，啟動(dòng)子序列所含的順式作用元件與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合決定基因的轉(zhuǎn)錄。家蠶絲膠1基因啟動(dòng)子中存在三個(gè)順式作用元件SA(-103～-85)、SB(-149～-135)和SC(-204～-183)，都能特異的與轉(zhuǎn)錄因子(SGF-1，SGF-3)結(jié)合[6]。絲腺轉(zhuǎn)錄因子1(SGF-1)屬于head/HNF-3家族，能特異結(jié)合SA位點(diǎn)，認(rèn)為決定了絲膠1基因的組織特異性表達(dá)[7]。體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)表明去除SA元件能下調(diào)絲膠1基因啟動(dòng)子的活性[6]。絲腺轉(zhuǎn)錄因子3(SGF-3)在絲腺核抽提物中含量最多，能與SC位點(diǎn)特異的結(jié)合，體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)同樣證明去除SC位點(diǎn)絲膠1基因啟動(dòng)子的活性也存在下調(diào)[8]。

我們?cè)诳寺〖倚Q絲膠1基因上游調(diào)控序列構(gòu)建中部絲腺特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同家蠶品系絲膠1基因上游調(diào)控序列存在差異，在調(diào)查的66個(gè)家蠶品系中，絲膠1基因上游調(diào)控序列的-1015～+48位置存在多態(tài)性，PCR擴(kuò)增結(jié)果有1063bp、636bp及同時(shí)出現(xiàn)這兩種條帶的情況[9]。家蠶(Bombyx mori)是由野桑蠶(Bombyx mandarina)馴化而來(lái)，二者的親緣關(guān)系很近。家蠶經(jīng)歷了強(qiáng)烈的人工選擇，成為了完全馴養(yǎng)的昆蟲(chóng)，并依賴(lài)人類(lèi)而生存，而野桑蠶完全在自然條件下生存。與家蠶相比，野桑蠶具有較強(qiáng)的疾病防御及抗逆能力，但其蠶繭大小、生長(zhǎng)速率等經(jīng)濟(jì)性狀則顯著弱于家蠶。本實(shí)驗(yàn)調(diào)查了不同地方的野桑蠶絲膠1基因上游調(diào)控序列，結(jié)果表明野桑蠶 sericin1上游調(diào)控序列也存在多態(tài)性，分別為636bp(HQ702378)及1061bp(HQ702379)。對(duì)野桑蠶絲膠1基因(HQ702380)編碼序列進(jìn)行克隆，通過(guò)序列比對(duì)，分析家蠶與野桑蠶絲膠1基因同源序列之間的差異，旨在為進(jìn)一步了解絲膠1基因的表達(dá)調(diào)控有所幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野桑蠶材料來(lái)自山東、重慶青木關(guān)、四川瀘州、資陽(yáng)、南充、湖南、蘇州和日本?？寺∮盟拗骶鶧H5α、質(zhì)粒pSLfa1180fa由本實(shí)驗(yàn)室保存。DNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自PROMEGA 公司 ;限制性?xún)?nèi)切酶 Hind III、Eco RI、Mlu I、Sal I和 Sma I及 pMD18-T-vector購(gòu)于TaKaRa公司;膠回收試劑盒購(gòu)于上海華舜公司。

1.2 野桑蠶絲膠1基因的克隆

以GenBank中登錄的家蠶絲膠1基因(sericin 1A)的核酸序列(AB112019.1)設(shè)計(jì)引物，Ser1 F:5'ATGCGT TTCGT TCTGTGCTGC 3'，Ser1 R:5'T TAGT TGTATTAAACACCGAT 3'，擴(kuò)增野桑蠶絲膠1基因。參照T ripure試劑說(shuō)明提取重慶青木關(guān)野桑蠶5齡第3天絲腺總RNA，然后以野桑蠶總RNA為模板，按M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的使用說(shuō)明進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。以野桑蠶cDNA為模板，用引物對(duì)Ser1 F/Ser1 R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性4 min;94℃30 s，55℃40 s，72 ℃4 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的產(chǎn)物，克隆到pMD18-T-vector中，酶切鑒定后送交上海英俊公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 野桑蠶絲膠1基因上游調(diào)控序列的克隆

根據(jù)GenBank中登錄的家蠶絲膠1基因上游調(diào)控序列(AB007831.1)和家蠶絲膠1基因mRNA序列(AB112019.1)設(shè)計(jì)引物，上游引物為 Ser1p F:5'AAAGCATAAGCGGTCAGAAACC 3'，下游引物 Ser1p R:5'GGTCTT TGGATCGCTTGATCC 3'，通過(guò)PCR擴(kuò)增野桑蠶絲膠1基因上游調(diào)控序列。野桑蠶基因組DNA的抽提采用蛋白酶K/RNA酶A的方法提取。以抽提的野桑蠶基因組DNA為模板，用引物對(duì)Ser1p F/Ser1p R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4min;94℃50 s，60℃55 s，72℃90 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸 10min。將PCR產(chǎn)物回收、克隆、酶切鑒定并測(cè)序。

1.4 序列分析

克隆的野桑蠶絲膠1基因序列用DNAStar軟件預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)序列與家蠶Sericin 1 A′(Ser 1A′，BAD00699.1)，sericin 1A(Ser 1A ，BAD00698.1)，sericin 1B(Ser 1B ，BAD00700.1)，sericin 1B(ser 1B，Q17240)作muscle序列分析。將測(cè)定的野桑蠶絲膠1基因上游調(diào)控序列和家蠶品系J115 Sericin 1上游調(diào)控序列及GenBank中登錄的Sericin 1上游調(diào)控序列AB007831.1作muscle序列分析。

2 結(jié)果

2.1 野桑蠶絲膠1基因的克隆

以5齡3天野桑蠶絲腺cDNA為模板，用引物對(duì)Ser1 F/Ser1 R擴(kuò)增得到一條約2.1 kb的條帶。將該片段回收連接到pMD18-T載體中，用Hind III和EcoRI雙酶切鑒定篩選的重組質(zhì)粒，酶切出一條長(zhǎng)度約2.1 kb的片段(圖1)。陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序后，由于野桑蠶絲膠1基因重復(fù)序列較多，導(dǎo)致不能拼接出完整的ORF序列。針對(duì)此種情況，先將克隆的野桑蠶絲膠1基因酶切，形成較小的片段后進(jìn)行亞克隆，亞克隆測(cè)序后再進(jìn)行拼接。將克隆的野桑蠶絲膠1基因用多種限制性?xún)?nèi)切酶分別進(jìn)行酶切，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mlu I可以將克隆的野桑蠶絲膠1基因酶切成約700 bp和1.4 kb的兩個(gè)片段。利用pMD18-T vector上Sal I和Sma I酶切位點(diǎn)，將克隆的野桑蠶絲膠1基因同時(shí)以 Mlu I、Sal I和Sma I進(jìn)行酶切，回收700 bp小片段亞克隆到pSLfa1180fa載體的Mlu I、Sal I位點(diǎn)，回收1.4 kb大片段亞克隆到pSLfa1180fa載體的Mlu I、Sma I位點(diǎn)。將兩個(gè)亞克隆經(jīng)酶切鑒定(圖2)及測(cè)序拼接，得到一條完整的ORF序列(GenBank登錄序列號(hào):HQ702380)。

圖1 野桑蠶絲膠1基因的PCR及重組質(zhì)粒的酶切檢測(cè)

圖2 亞克隆酶切鑒定

2.2 野桑蠶絲膠1基因上游調(diào)控序列克隆

以8個(gè)不同地方野桑蠶基因組DNA為模板，用引物對(duì)Ser1p F/Ser1p R進(jìn)行野桑蠶絲膠1基因上游調(diào)控序列PCR擴(kuò)增，從山東野桑蠶基因組DNA中擴(kuò)增出一條約1kb條帶，從湖南野桑蠶、四川南充野桑蠶和重慶青木關(guān)野桑蠶基因組DNA中擴(kuò)增出一條約600bp條帶，另外4個(gè)樣品沒(méi)有擴(kuò)增結(jié)果(圖3)。將擴(kuò)增出約600bp條帶的青木關(guān)野桑蠶及擴(kuò)增出1kb條帶的山東野桑蠶的PCR產(chǎn)物回收后，克隆到pMD18-T載體。重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酶切驗(yàn)證后進(jìn)行測(cè)序。

圖3 野桑蠶Sericin1啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增

2.3 野桑蠶絲膠1基因序列分析

克隆的野桑蠶Sericin 1序列用DNAStar預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)序列與家蠶Sericin 1A′(Ser1 A′，BAD00699.1)、Sericin 1A(Ser1 A ，BAD00698.1)、Sericin 1B作 muscle序列分析(圖4)，結(jié)果表明:預(yù)測(cè)的野桑蠶絲膠1蛋白與家蠶Sericin 1 A′、Sericin 1A、Sericin 1B(Ser 1B，BAD00700.1)、Sericin 1B(ser 1B，Q17240)有較強(qiáng)的相似性，相似性分別為 98%、98%、92%、97%。據(jù)Garel等預(yù)測(cè)的絲膠1蛋白(Ser 1B，Q17240)一級(jí)結(jié)構(gòu)中，Ser 1B多肽中含1、2、3、4、5、7、8、9外顯子[4]，而野桑蠶絲膠 1蛋白與家蠶Ser1 A′相似性最高，其只含1、2、7、8、9外顯子，因此將克隆的2176bp野桑蠶絲膠1基因命名為B.mandarin Sericin1 A′。野桑蠶絲膠蛋白中存在由38個(gè)氨基酸組成的重復(fù)序列，包含約40%的絲氨酸(圖5)，正是由于這些重復(fù)序列導(dǎo)致測(cè)序后拼接非常困難，利用內(nèi)切酶切成小片段亞克隆后才完成拼接。

2.4 野桑蠶絲膠1基因上游調(diào)控序列分析

將克隆的野桑蠶Sericin 1上游調(diào)控序列與我們之前克隆的家蠶J115品系Sericin 1上游調(diào)控序列，及GenBank中登錄的Sericin 1上游調(diào)控序列AB007831.1作muscle序列分析，結(jié)果表明克隆的山東野桑蠶Sericin 1上游調(diào)控序列、青木關(guān)野桑蠶Sericin 1上游調(diào)控序列片段和家蠶Sericin 1上游調(diào)控序列具有很強(qiáng)的相似性。1061bp絲膠1基因上游調(diào)控序列是636bp絲膠1基因上游調(diào)控序列中插入約400bp的片段，而前后約300bp是一致的，克隆的野桑蠶絲膠1基因上游調(diào)控序列中也存在SA、SB和SC基序(圖6)?？寺〉囊吧ＰQ絲膠1基因上游調(diào)控序列在GenBank中登錄序列號(hào)分別為HQ702380和HQ702379。

圖4 預(yù)測(cè)的野桑蠶絲膠1蛋白序列與家蠶絲膠1蛋白序列比對(duì)

圖5 野桑蠶絲膠1蛋白序列的重復(fù)基序

圖6 野桑蠶Sericin 1上游調(diào)控序列與家蠶Sericin 1上游調(diào)控序列比對(duì)分析

3 討論

家蠶絲膠1基因在基因組中是單拷貝的，轉(zhuǎn)錄后通過(guò)不同的剪切方式形成4條mRNA，其長(zhǎng)度分別為10.5kb、9.0kb、4.0kb和2.8kb[3]。Garel等指出在家蠶絲膠1基因剪切時(shí)1、2、7、8和9外顯子存在于所有形式的mRNA中，而3、4、5和6外顯子是選擇性剪切的，所有外顯子都包含的絲膠1基因mRNA命名為Ser1C，不包含3和4外顯子的絲膠1基因mRNA命名為Ser1D;不包含外顯子6的絲膠1基因mRNA命名為Ser1B;不包含外顯子3和6的絲膠1基因mRNA命名為Ser1A;不包含外顯子3、4、5和6的絲膠 1基因mRNA命名為Ser1A′[4]。而本實(shí)驗(yàn)克隆的重慶野桑蠶絲膠1基因編碼序列與家蠶Ser1A′相似性非常高，其僅包含絲膠1基因的1、2、7、8和9外顯子，故將其命名為野桑蠶Ser1A′。野桑蠶Ser1A′富含絲膠1基因的特征性重復(fù)基序，正是由于重復(fù)基序的存在，完整的野桑蠶Ser1A′編碼序列在測(cè)序時(shí)形成特殊的結(jié)構(gòu)而造成測(cè)序困難，而將野桑蠶Ser1A′編碼序列酶切為較小的兩個(gè)片段后，分別克隆到pSLfa1180載體然后進(jìn)行測(cè)序，由于序列重復(fù)度減小，兩個(gè)亞克隆測(cè)序后經(jīng)拼接得到完整的Ser1A′編碼序列。

在調(diào)查不同地方野桑蠶絲膠1基因上游調(diào)控序列多態(tài)性時(shí)，發(fā)現(xiàn)與家蠶相似，也存在1061bp與636bp兩種PCR擴(kuò)增情況，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在同一個(gè)地方個(gè)體中同時(shí)存在636bp和1061bp的情況，而這種情形在家蠶中也是存在的[9]，這可能與我們調(diào)查的同一個(gè)地方樣品數(shù)量少有關(guān)。除此之外，野桑蠶絲膠1基因上游調(diào)控序列與家蠶絲膠1基因上游調(diào)控序列間存在極強(qiáng)的相似性，絲膠基因表達(dá)調(diào)控的三個(gè)順式作用元件都位于相應(yīng)的位點(diǎn)。

家蠶由野桑蠶馴化而來(lái)，目前對(duì)家蠶絲膠基因的研究比較多，而對(duì)野桑蠶絲膠1基因的研究報(bào)道較少，本研究在家蠶絲膠1基因研究基礎(chǔ)上，僅克隆了野桑蠶絲膠1基因Ser1A′，而野桑蠶中的絲膠1基因其它不同剪切方式則有待研究。

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