武玉蓮，韓 鴻，周海林，丁 莉，武 蕓，*

(1.湖北民族學(xué)院 附屬醫(yī)院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；3.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北民族學(xué)院)，湖北 恩施 445000)

五鶴續(xù)斷為川續(xù)斷科川續(xù)斷屬植物川續(xù)斷(DipsacusasperWall.)，具有耐嚴(yán)寒、喜濕潤(rùn)等特征，無(wú)病蟲(chóng)害等特點(diǎn)，是恩施州最佳道地藥材之一[1].其干燥根具有續(xù)接筋骨、補(bǔ)肝益腎、抗骨質(zhì)疏松和止血安胎等功效，臨床上可用來(lái)治療跌打損傷，骨折，腰膝酸軟，腰椎骨質(zhì)增生，先兆性流產(chǎn)和習(xí)慣性流產(chǎn)等癥狀[2-3].

開(kāi)發(fā)藥用植物資源的一個(gè)重要方面就是擴(kuò)大和利用藥用部位.五鶴續(xù)斷的尾須和莖苗可開(kāi)發(fā)成飼料產(chǎn)品.同時(shí)，五鶴續(xù)斷還可開(kāi)發(fā)用于煲湯及酒制劑，續(xù)斷可藥食通用，可開(kāi)發(fā)成為良好的保健和功能食品.

五鶴續(xù)斷組織培養(yǎng)已有報(bào)道[4-5]，但其多倍體誘導(dǎo)還未見(jiàn)報(bào)道.本研究采用秋水仙素對(duì)五鶴續(xù)斷幼苗、萌發(fā)種子及其愈傷組織進(jìn)行多倍體的誘導(dǎo)，為續(xù)斷的藥用成分的提取、品種改良及相關(guān)的科學(xué)研究提供依據(jù)，有一定的應(yīng)用價(jià)值和理論價(jià)值.

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料五鶴續(xù)斷來(lái)自湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院苗圃.

1.2 多倍體誘導(dǎo)方法

1.2.1 不同濃度的秋水仙素溶液處理續(xù)斷萌發(fā)種子 先將續(xù)斷種子催芽，待露出根尖后，分別浸泡在不同濃度的秋水仙素溶液中處理不同時(shí)間，然后在流水下沖洗5～10 min，種在花盆(蛭石∶草炭=3∶1)中.

表1 不同濃度的秋水仙素對(duì)續(xù)斷萌發(fā)種子不同的處理時(shí)間

表2 不同濃度的秋水仙素對(duì)續(xù)斷無(wú)菌萌發(fā)種子不同的處理時(shí)間

表3 不同濃度的秋水仙素對(duì)續(xù)斷幼苗不同的處理時(shí)間

表4 不同濃度秋水仙素處理續(xù)斷萌發(fā)種子的多倍體的效應(yīng)

1.2.2 不同濃度秋水仙素溶液處理續(xù)斷無(wú)菌萌發(fā)種子 先將種子浸泡2～3 h，去除堅(jiān)硬的果皮，在流水下沖洗2～3 h，在超凈工作臺(tái)上用75%的酒精泡0.5～1 min，在0.1%的升汞中處理6～8 min，用無(wú)菌水沖洗4～6次，接種在MS培養(yǎng)基上，待其長(zhǎng)出幼根后，用不同濃度的無(wú)菌秋水仙素溶液處理相應(yīng)的時(shí)間，秋水仙素處理環(huán)境為23℃黑暗條件下，處理完后用無(wú)菌水沖洗6～8次，將其種植在花盆(蛭石∶草炭=3∶1)中.

1.2.3 秋水仙素溶液處理續(xù)斷幼苗 用脫脂棉吸取不同濃度秋水仙素溶液，覆蓋在盆栽的具兩個(gè)葉片小苗的葉間頂芽處，并用黑色透氣薄膜包扎，以后每隔5 h用注射器滴加對(duì)應(yīng)濃度的秋水仙素溶液，處理一定時(shí)間后，取下黑色透氣薄膜，用清水沖洗放置棉球的地方.待頂芽生長(zhǎng)30 d后取葉片表皮細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)特性觀察.

1.2.4 染色體檢測(cè) 取經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后的續(xù)斷植株的根尖、莖尖和葉片，用孚爾根染色法鑒別細(xì)胞核中的DNA.取經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的根尖、莖尖和葉片于0.05%秋水仙堿溶液中浸泡2.5 h左右；水洗后用乙醇∶冰醋酸(3∶1) 固定液固定6 h(一部分繼續(xù)以下步驟，令一部分轉(zhuǎn)入70%乙醇中冰箱保存)；再用水洗兩次，投入試管，加入1 M鹽酸溶液浸沒(méi)材料，在60℃下水解10 min，待軟化(明顯變?yōu)榘胪该?，取出用蒸餾水換洗2次；在試管中加入希夫試劑，浸沒(méi)材料，立即置于暗處處理1 h，然后用漂洗液換洗3次，每次2 min；分別取材料，置于載玻片上，滴一滴45%醋酸溶液，然后壓片鏡檢.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的秋水仙素溶液處理續(xù)斷萌發(fā)種子多倍體的誘導(dǎo)

用不同含量的秋水仙素溶液浸泡處理五鶴續(xù)斷種子后，種植在裝有大黃土的花盆中.結(jié)果表明(見(jiàn)表4)，用0.2%的秋水仙素溶液處理42 h或48 h和0.3%的秋水仙素溶液處理36 h的外植體明顯變肥變粗，誘變率均為100%.由此說(shuō)明秋水仙素溶液的不同濃度和不同處理時(shí)間，對(duì)五鶴續(xù)斷種子的萌發(fā)率和多倍體誘導(dǎo)率都有很大影響，但由于后期的培養(yǎng)使得處理材料全部死亡，有待重新考慮和找出是秋水仙素處理濃度和時(shí)間的原因還是生長(zhǎng)環(huán)境造成的原因.

2.2 不同濃度的秋水仙素溶液處理續(xù)斷無(wú)菌萌發(fā)種子多倍體的誘導(dǎo)

用不同濃度的秋水仙素溶液浸泡處理五鶴續(xù)斷無(wú)菌種子，并接種在MS培養(yǎng)基上3 d后，胚根開(kāi)始生長(zhǎng)，以后子葉開(kāi)始陸續(xù)伸展.從剛萌發(fā)的種子的形態(tài)觀察，可以看出用高含量的秋水仙素溶液長(zhǎng)時(shí)間的處理植物材料可提高多倍體誘變率，但選擇適宜的秋水仙素溶液濃度和處理時(shí)間非常重要的.本研究從萌發(fā)的種子的形態(tài)觀察選擇用0.2%秋水仙素溶液處理42 h或48 h和0.3%秋水仙素溶液處理36 h的外植體明顯變粗，變肥變粗率均為100%.待其生長(zhǎng)30 d后取其根尖鏡檢，結(jié)果表明，對(duì)照組染色體數(shù)2n=18，與文獻(xiàn)記載相符[6]，處理組細(xì)胞染色體數(shù)2n=36.

表5 不同濃度秋水仙素處理續(xù)斷無(wú)菌萌發(fā)種子的多倍體效應(yīng)

2.3 秋水仙素溶液處理續(xù)斷幼苗

經(jīng)誘變處理后的五鶴續(xù)斷幼苗所產(chǎn)生的葉片在外觀上與對(duì)照組有較大的差別.對(duì)照組葉片薄、葉面平整淺綠色并有一定韌性，表皮細(xì)胞易撕取，氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞均小些；用0.2%的秋水仙素溶液處理42或48 h和0.3%的秋水仙素溶液處理36 h后具有明顯的多倍體特征：葉片明顯加厚，葉色深綠，葉面粗糙，脈紋加深，葉脆易折斷，葉邊緣常發(fā)生反卷.

3 討論

選育藥用植物優(yōu)良品種是提高中藥材質(zhì)量和產(chǎn)量的有效途徑.由于多倍體使藥用植物染色體加倍，器官的“巨型性”特征，能較好地提高藥材的產(chǎn)量；同時(shí)，加倍染色體上基因調(diào)控有效化學(xué)成分含量往往較正常二倍體高，因而多倍體也可提高藥材的質(zhì)量.但是，不同的材料對(duì)秋水仙素的敏感程度不同，即使是同一種材料，其濃度不同和處理時(shí)間不同對(duì)多倍體的形成影響很大.故選擇適宜的秋水仙素濃度和處理時(shí)間對(duì)染色體加倍的誘導(dǎo)至關(guān)重要.張志勝等[7]用0.2%的秋水仙素溶液誘導(dǎo)處理紅掌愈傷組織14 h，獲得多倍體誘導(dǎo)率高達(dá)45.5%；王真等[8]用0.05%的秋水仙素處理萌動(dòng)種子12 h，誘變率達(dá)11%，用0.1%的秋水仙素點(diǎn)滴法處理二倍體幼苗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)48 h，誘變率達(dá)75%；王曉紅等[9]用0.05%的秋水仙素溶液誘導(dǎo)處理非洲菊叢生芽12 h，誘變率可達(dá)38.46%；彭靜等[10]用0.4%的秋水仙素溶液處理芽體48 h誘導(dǎo)率達(dá)18.64%.

用秋水仙素誘導(dǎo)植物多倍體的方式較多，本試驗(yàn)用五鶴續(xù)斷種子的萌發(fā)條件下多倍體誘變，雖然開(kāi)始誘導(dǎo)率較高，但誘導(dǎo)后的材料出現(xiàn)枯根性死亡，而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，植物死亡程度越高；而采用幼苗莖尖秋水仙素處理誘變過(guò)程較好，幼苗生長(zhǎng)情況也較好.用0.2%的秋水仙素溶液處理幼苗莖尖42或48 h和0.3%的秋水仙素溶液處理幼苗莖尖36 h的誘導(dǎo)率較高，誘導(dǎo)后植物材料具有明顯的多倍體外形特征，是一種可取的誘導(dǎo)方法.

參考文獻(xiàn):

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