龔 宇 張瑩雯

武漢大學(xué)中南醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科,武漢 430071

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetesmellitus,DM)最嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥之一,其基本病理改變?yōu)樵缙谀I小球血管功能異常和腎小球系膜外基質(zhì)(ex tra cellular m atrix,ECM)進(jìn)行性積聚,從而導(dǎo)致基底膜(glomerular basementmembrane,GBM)增厚,同時(shí)伴有腎小管-間質(zhì)纖維化和彌漫性腎小球與結(jié)節(jié)性腎小球肥大、硬化。而腎小球系膜細(xì)胞(glom erular mesangial cell,GMC)是腎小球固有細(xì)胞中合成ECM最強(qiáng)的細(xì)胞,GMC增生、肥大及分泌的ECM進(jìn)行性積聚是導(dǎo)致腎小球硬化的特殊間質(zhì)效應(yīng)細(xì)胞,在DN的發(fā)病中起關(guān)鍵作用。DN屬中醫(yī)學(xué)“消渴”證中的“下消”范疇,多為肝腎虧虛,瘀阻絡(luò)脈。臨床多采用益氣養(yǎng)陰、滋補(bǔ)肝腎、生津止渴、活血等中藥治療。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)的大鼠GMC,研究了當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)高糖條件下GMC增殖的影響,以探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯在預(yù)防DN發(fā)生、發(fā)展及DN時(shí)蛋白尿的作用,并為臨床應(yīng)用當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療DN提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只清潔型SD成年雄性大鼠,體重180～200 g,4～6周齡,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):[SCXK(鄂)2003-00004]。

1.1.2 藥材及試劑 當(dāng)歸補(bǔ)血湯(由黃芪、當(dāng)歸組成:5∶1),按要求稱(chēng)取后,水浸泡30 m in后,煎3次,每次煎開(kāi)10min后過(guò)濾取汁,將3次混合,并統(tǒng)一濃縮至2 kg/L藥液,由武漢大學(xué)中南醫(yī)院中藥房煎制;格列齊特,由湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),批號(hào):090707;鏈脲佐菌素(STZ),美國(guó)Sigm a公司;M TT溶液,凌飛科技;RPM I-1640培養(yǎng)液,美國(guó)Hyclone公司;胎牛血清(fetalbovine serum,FBS),杭州四季青生物工程材料公司提供;超凈工作臺(tái),蘇州凈化;37℃5%CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱,美國(guó)Thermo Forma公司;Lambda25紫外分光光度計(jì),美國(guó)PE公司;BIO-PROFIL凝膠成像系統(tǒng),法國(guó)Vilber Lov rma公司;Trizol試劑,美國(guó)Introgen公司;Genios Plus多功能酶標(biāo)儀,奧地利TECAN公司;NF-κB一抗兔抗鼠及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗羊抗兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備 所有大鼠禁食12 h后,其中42只一次性腹腔注射1%STZ 55.0mg/kg(溶于0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中,pH 4.2),72 h后取尾靜脈血,空腹血糖≥16.7mmol/L者納入實(shí)驗(yàn),隨機(jī)分為正常組(NC組,8只)、模型組(HG組,10只)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組(DHG5組,8只)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組(DHG10組,8只)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組(DHG20組,8只)、格列齊特組(GL組,8只)。實(shí)驗(yàn)第4日開(kāi)始,每日定時(shí)灌胃,按大鼠與人等效劑量折算方法,GL組給予格列齊特1.5 mg/kg灌胃;DHG20組給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯3.6 g/kg灌胃,DHG10組給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯2.4 g/kg灌胃,DHG5組給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯1.2 g/kg灌胃,NC和HG不給藥,每日灌相同容量蒸餾水,1次/d。實(shí)驗(yàn)期間自由飲水、進(jìn)食,不使用胰島素及其他降糖藥物,連續(xù)8周,在末次灌胃10 h后麻醉,在無(wú)菌條件下經(jīng)腹主動(dòng)脈采血,離心取血清,56℃水浴30 m in滅活補(bǔ)體,經(jīng)過(guò)濾除菌,分裝凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 系膜細(xì)胞 在無(wú)菌條件下取出生3～5 d SD大鼠鼠嬰腎,去除腎胞膜,將皮質(zhì)剪碎后用0.25%胰蛋白酶溶液消化,當(dāng)細(xì)胞分散成單個(gè)時(shí),用培養(yǎng)液終止消化,吹勻后接種于含20%的FBS、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的RPM I-1640培養(yǎng)液中(用Hepes和NaHCO3調(diào)pH至7.2～7.4),分瓶后置37℃、5%CO2的飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),至90%匯合時(shí),用0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代,傳代可獲得較純的腎小球系膜細(xì)胞。

1.2.3 GMC鑒定 ①倒置顯微鏡下觀察其典型的形態(tài)學(xué)特征:細(xì)胞鋪滿瓶底;②超微結(jié)構(gòu)觀察:透射電鏡下GMC呈星形或梭形,胞質(zhì)內(nèi)除有少量分布的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體外,還有最為特征性的是位于胞膜下和細(xì)胞突起向內(nèi)的微絲結(jié)構(gòu),核居中央,多呈圓形或卵圓形,核染色質(zhì)較為稀疏。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分組NC組(常規(guī)培養(yǎng),僅20%正常大鼠血清)、HG(30 mmol/L D-glucose加10%FBS)、DHG5組(5%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清加30 mmol/L D-glucose加10%FBS)、DHG10組(10%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清加30 mmo l/L D-glucose加10%FBS)、DHG20組(20%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清加30 mm ol/L D-g lucose加10%FBS)及GL組(10%格列齊特含藥血清加30mmol/LD-glucose加10%FBS)。

1.2.5 M TT法檢測(cè)GMC的表達(dá) 用0.25%胰蛋白酶消化培養(yǎng)的GMC,再用含20%胎牛血清的RPM I-1640培養(yǎng)液稀釋為單個(gè)細(xì)胞懸液,以×104細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板。24 h后細(xì)胞完全貼壁展開(kāi),用含1%胎牛血清的RPM I-1640培養(yǎng)液24 h同步化細(xì)胞,每孔100μl,實(shí)驗(yàn)分組同1.2.4,每組濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔,共種3個(gè)板(24、48和72 h各一塊板),其他條件相同。將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中,分別培養(yǎng)到預(yù)定時(shí)間后,去上清,每孔加入M TT溶液(5 mg/ml,PBS)100μl,37℃避光繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng)。吸去孔內(nèi)上清液,每孔加入100μl DMSO溶解液振蕩10 m in,待結(jié)晶物充分溶解后(溶液呈藍(lán)紫色),酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔吸光度值(A570)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

在24 h內(nèi)僅HG組增殖較快(P＜0.05),其余各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);在一定時(shí)間和相應(yīng)糖濃度的作用下其增殖能力加強(qiáng)(48 h HG組與NC組相比,P＜0.05),隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和糖濃度的增加,其增殖能力更強(qiáng)(72 h HG組與NG組相比,P＜0.01),說(shuō)明高糖有促進(jìn)GMC增殖的作用。另外,不同含量的含藥血清對(duì)高糖條件下GMC增殖有一定的抑制作用,以DHG20和格列齊特組最為明顯(24、48 h與HG組相比,P＜0.05),并呈時(shí)間和計(jì)量關(guān)系(72 h與HG組相比,P＜0.01);而DHG10與HG組相比,僅在72 h有意義(P＜0.05);而DHG5、DHG10與DHG20組在作用的72 h相比,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),而GL組與DHG20組相比,其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組24、48和72 h的GMC增殖情況(n=4,±s)

表1 各組24、48和72 h的GMC增殖情況(n=4,±s)

與NC組比較▲P＜0.05,▲▲P＜0.01;與HG組比較△P＜0.05,△△P＜0.01;與DHG20組比較#P＜0.05,##P＜0.01

組別24 h 48 h 72 h NC組1.195±0.074△1.193±0.100△1.252±0.123△△HG組0.839±0.050▲0.779±0.073▲0.589±0.084▲▲DHG 5組0.753±0.069##0.717±0.079##0.690±0.085##DHG 10組0.877±0.051##0.816±0.054##0.769±0.032△#DHG 20組1.189±0.044△1.108±0.047△0.946±0.098△△GL組1.182±0.062△1.087±0.065△0.872±0.047△△

3 討論

近年來(lái),糖尿病患者迅猛增加,全球現(xiàn)有兩億多糖尿病患者,其中80%的患者生活在發(fā)展中國(guó)家[1],其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。糖尿病已成為繼心血管和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病[2]。DN是糖尿病最為嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一,由DN引發(fā)的終末期腎功能衰竭(end-stage renal disease,ESRD)正在成為威脅糖尿病患者生命的主要原因。

DN基本病理特點(diǎn)為腎小球內(nèi)高壓、高灌注、高濾過(guò)而出現(xiàn)微量蛋白尿,進(jìn)而漸進(jìn)性系膜擴(kuò)張,GBM增厚和ECM積聚和足細(xì)胞的減少而出現(xiàn)大量蛋白尿,最后腎小囊玻璃滴狀病變,腎小球毛細(xì)血管袢纖維素樣或類(lèi)脂樣帽狀病變和腎小球彌漫性、結(jié)節(jié)性硬化[3]。微量清蛋白尿是DN早期臨床診斷指標(biāo),而大量蛋白尿的出現(xiàn)則預(yù)示著腎小球病變不可逆轉(zhuǎn),DN患者在短期內(nèi)將進(jìn)入終末期腎功能衰竭。腎小球?yàn)V過(guò)屏障是腎小球的重要結(jié)構(gòu),由內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、足細(xì)胞及其裂孔隔膜三層結(jié)構(gòu)所構(gòu)成,濾過(guò)屏障的完整性在阻止蛋白質(zhì)漏出中起關(guān)鍵作用。GBM作為濾過(guò)屏障的重要組成部分在蛋白尿的產(chǎn)生中起重要作用。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與正常濃度葡萄糖組比較,隨著葡萄糖濃度增加,GMC出現(xiàn)明顯增殖時(shí)間縮短(P＜0.05或P＜0.01)。而MTT測(cè)定結(jié)果顯示:在相同濃度的葡萄糖作用下,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),GMC增殖更加明顯(P＜0.01或P＜0.05),說(shuō)明高糖可以促進(jìn)GMC增殖,這與Wolf等[4-6]研究結(jié)果一致,在高糖(25 mmol/L glucose-DMEM)條件下,S期的GMC百分比明顯增加,G0/G1期的細(xì)胞百分比明顯減少[7]。通過(guò)用不同種類(lèi)、不同濃度的含藥血清對(duì)不同濃度下的GMC干預(yù)后發(fā)現(xiàn),高濃度的當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)GMC增殖有較強(qiáng)的抑制作用,這種抑制作用與藥物作用時(shí)間和濃度呈正相關(guān)(在實(shí)驗(yàn)的72 h,與NC組相比,DHG5組P＞0.05,DHG 10組P＜0.05,DHG20組P＜0.01),說(shuō)明在DN條件下,高糖環(huán)境、GMC增殖在DN的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[8-9],推測(cè)抑制GMC增殖能有效的預(yù)防和治療高糖血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷及DN的發(fā)生、發(fā)展。

DN屬中醫(yī)學(xué)的“腎消”、“下消”、“水腫”、“尿濁”、“關(guān)格”、“溺毒”等范疇。病變特點(diǎn)為肝腎陰虛為其本,肺胃燥熱為其標(biāo),痰、濕、濁、瘀為其因,氣血損傷,經(jīng)絡(luò)瘀阻為其變,陰陽(yáng)俱虛、臟腑損傷及水濕潴留為其果。當(dāng)歸補(bǔ)血湯源于金代李呆的《內(nèi)外傷辨惑論?暑傷胃氣論》,全方由黃芪、當(dāng)歸(5∶1)組成,又名黃芪當(dāng)歸湯、補(bǔ)血湯、芪歸湯等,是中國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)氣兼養(yǎng)血的代表方劑,主治勞倦內(nèi)傷、氣弱血虛、陽(yáng)浮外越,能增強(qiáng)免疫,調(diào)節(jié)血液系統(tǒng)及血糖含量,起到保護(hù)心血管系統(tǒng)、護(hù)肝及抗氧化等作用。現(xiàn)代中藥藥理研究:當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠改善DN大鼠GBM不規(guī)則增厚,足細(xì)胞排列紊亂且發(fā)生融合,腎小管上皮細(xì)胞腫脹,大量空泡變性,線粒體體積增大、形態(tài)變圓,線粒體嵴脫落;降低血糖、膽固醇、三酰甘油,提高高密度脂蛋白,逆轉(zhuǎn)腎臟肥大,腎重/體重的增加,改善系膜增生,進(jìn)而減輕ECM積聚和腎臟肥大[10]。還能有效地降低腎小球和腎小管TGF-β1m RNA表達(dá)量[11];此外歸芪方能改善血糖及脂質(zhì)代謝紊亂,并能降低尿微量清蛋白及β2-微球蛋白排泄率,緩解腎損傷[12];林為民等和徐寧等[13-14]通過(guò)大量的臨床觀察也證明當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)DN的明顯改善作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸補(bǔ)血湯可明顯抑制GBM的增殖,加強(qiáng)濾過(guò)屏障的保護(hù)作用,恢復(fù)正常的電荷屏障,改善蛋白尿,從而延緩DN的病情進(jìn)展,保護(hù)腎功能。但其抑制高糖條件下GBM增殖的作用機(jī)制還須進(jìn)一步研究。

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