王欽富，李坤，李志，徐娜，董敏，韓慧

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β 激活激酶（transforming growth factor-β-activating kinase 1，Tak1）為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在功能與序列上與絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mitogen—activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK）相關(guān)，屬于 MAPKKKs 家族成員。眾多研究表明 Tak1 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了炎癥（如膿毒癥）、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和纖維化疾病等病理生理過(guò)程以及細(xì)胞周期調(diào)控與細(xì)胞分化等過(guò)程，因而 Tak1 參與調(diào)控的信號(hào)通路與人類(lèi)疾病的關(guān)系日益受到普遍關(guān)注。Tak1 基因在 T、B 免疫細(xì)胞中起到非常重要的作用，但在髓樣細(xì)胞中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本文利用 siRNA 技術(shù)使小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 Tak1 基因沉默并觀察其生物學(xué)效應(yīng)，初步探討 Tak1 基因在髓樣細(xì)胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明純種小鼠（No：SCXK2002-0002），II 級(jí)，體重 18～22 g，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。靶向Tak1 基因的 siRNA（正義鏈 5’ GCUCAUGCCAU GAGCUGGUGUUUAC 3’，反義鏈 5’ GUAAACAC CAGCUCAUGGCAUGAGC 3’，MSS218539）、Trizol總 RNA 抽提試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 Super Strip III為美國(guó)Invitrogen 公司產(chǎn)品；IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒為美國(guó) R&D 公司產(chǎn)品；NucleofectorTM試劑為德國(guó) Amaxa 公司產(chǎn)品。巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM 培養(yǎng)液，加 10%胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺（使終濃度為2mmol/L）。無(wú)水乙醇、氯仿、異丙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純；焦碳酸二乙酯（DEPC）為美國(guó) Sigma 公司產(chǎn)品。Prism 7700 PCR儀為美國(guó) ABI 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 取昆明純種小鼠，腹腔注射 4%巰基乙醇酸鈉（thioglycolate）1～2 ml，3～5 d 后行麻醉、脫頸致死，用巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液灌洗腹腔，吸出培養(yǎng)液，放入無(wú)菌平皿鋪板 3～5 h，吸棄上清，用培養(yǎng)液洗滌 1 次，備用。

1.2.2 siRNA 基因沉默的最佳轉(zhuǎn)染濃度和時(shí)間的優(yōu)化 備用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 100 g，洗滌 5min，取 1.5×106個(gè)巨噬細(xì)胞加 100 μl Nucleofactor 溶液，分別加入 0.6、1.2、1.6 μmol/L Tak1 siRNA，混勻，并設(shè)立空白對(duì)照。移入電轉(zhuǎn)杯（勿產(chǎn)生氣泡），放置電轉(zhuǎn)儀，實(shí)施轉(zhuǎn)染。然后移入預(yù)溫的培養(yǎng)板中培養(yǎng)，24 h 后收集細(xì)胞，Trizol reagent 法提取總RNA，進(jìn)行熒光定量 PCR，檢測(cè) Tak1 mRNA 表達(dá)。Tak1 引物序列：正義鏈 5’ ATTCCACAGATAC CAATGGCTC 3’；反義鏈 5’ TGTAGTAACAATGC GATTTCGG 3’。RNA 濃度和純度檢測(cè)，按常規(guī)方法操作。按照 Super Strip III 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR，同時(shí)設(shè)計(jì)出內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的引物（序列：正義鏈 5’ AGGGCATCT TGGGCTACAC 3’；反義鏈 5’ TGGTCCAGGGTTT CTTACTCC 3’），在檢測(cè) Tak1 基因 mRNA 的同時(shí)對(duì)每個(gè)樣品中 GAPDH 的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，以校正不同樣品之間因 RNA 總量、質(zhì)量及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率差異所導(dǎo)致的目的基因的表達(dá)差異。取 5 μl cDNA進(jìn)行熒光定量 PCR。循環(huán)條件：94℃預(yù)變性 3min，94℃變性 45 s，55℃退火 45 s，共進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)。

1.2.3 Western blotting 技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá) 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 100 g，洗滌 5min，取 1.5×106個(gè)巨噬細(xì)胞加 100 μl Nucleofactor 溶液，分別加入0.6、1.2、1.6 μmol Tak1 siRNA，并設(shè)立空白對(duì)照，轉(zhuǎn)染后接種 24 孔板，密度 6×105個(gè)/ml，每孔500 μl。siRNA 轉(zhuǎn)染后 48 h 進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取，BCA 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。各組樣本均取總蛋白質(zhì)15 μg 上樣，經(jīng) 100 g/L 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)后轉(zhuǎn) PVDF 膜。與兔抗小鼠 Tak1多克隆一抗 4℃孵育過(guò)夜。與 HRP 標(biāo)記的羊抗兔 IgG 抗體室溫孵育 1 h 后，ECL 顯色，暗室中觀察，膠片曝光記錄結(jié)果。同時(shí)用 β-actin 作為內(nèi)參確證蛋白上樣量一致。

1.2.4 siRNA 轉(zhuǎn)染對(duì)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平的影響 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞按前述方法加入1.6 μmol Tak1 siRNA，并設(shè)立空白對(duì)照，轉(zhuǎn)染后接種 48 孔板，密度 6×105個(gè)/ml，每孔 250 μl。轉(zhuǎn)染后 24 h 加入 100 ng/ml 脂多糖（LPS），24 h 后收集上清，ELISA 法檢測(cè) IL-1β 表達(dá)水平。設(shè)立3 個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用 SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，多個(gè)樣本均數(shù)間的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，兩樣本比較采用配對(duì)資料t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA 基因沉默的最佳轉(zhuǎn)染濃度

細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Tak1 siRNA，設(shè)立空白對(duì)照，轉(zhuǎn)染24 h 后收集細(xì)胞檢測(cè) mRNA 水平（圖1）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各組抑制率分別為69.73%、80.85%、88.78%。不同濃度 siRNA 與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

圖1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染后 Tak1 mRNA 表達(dá)水平Figure 1 Tak1 mRNA level of Tak1 siRNA transfected mouse peritoneal macrophage

2.2 siRNA 轉(zhuǎn)染后 Tak1 基因蛋白的變化

細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Tak1 siRNA，設(shè)立空白對(duì)照，轉(zhuǎn)染48 h 收集細(xì)胞，用 Western blotting 法檢測(cè) Tak1蛋白表達(dá)。各濃度 Tak1 siRNA 轉(zhuǎn)染后 48 h Tak1蛋白表達(dá)明顯減弱。β-actin 各組無(wú)差異（圖2）。

圖2 Tak1 siRNA 下調(diào)正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞結(jié)果Figure 2 Tak1 expression of Tak1 siRNA transfected normal mouse peritoneal macrophage

圖3 Tak1 siRNA 轉(zhuǎn)染對(duì)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子 IL-1β水平的影響Figure 3 IL-1β secretion of Tak1 siRNA transfected macrophage

2.3 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平的影響

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Tak1 siRNA，濃度1.6 μmol/L，設(shè)立空白對(duì)照，轉(zhuǎn)染 24 h加入 LPS，24 h 后收集培養(yǎng)細(xì)胞上清進(jìn)行 IL-1β 表達(dá)水平檢測(cè)（圖3）。轉(zhuǎn)染組 IL-1β 表達(dá)水平為（248.7±66.3）pg/ml，顯著高于對(duì)照組（41.1±7.9）pg/ml（P＜0.01）。

3 討論

Tak1 在天然免疫和獲得性免疫中起著關(guān)鍵作用。Sato 等[1]采用 cre-loxp 技術(shù)條件性敲除 B 細(xì)胞中 Tak1 基因，證實(shí) Tak1 在B細(xì)胞 NF-κB 活化及 JNK 活化中不可或缺。隨后 Sato 等[2]又構(gòu)建Tak1 缺失 T 細(xì)胞小鼠，證實(shí) Tak1 在 TCR 介導(dǎo)NF-κB 活化及 MAPKs（mitogen-activated protein kinase）活化，以及 T 細(xì)胞成熟、增殖中的關(guān)鍵作用。Wan 等[3]也證實(shí) Tak1 在 T 細(xì)胞發(fā)生、增殖、成熟中的作用， Tak1 缺失 T 細(xì)胞小鼠胸腺細(xì)胞發(fā)育，特別是 Treg 細(xì)胞發(fā)育減少，NF-κB 活性及JNK 活性降低。Liu 等[4]也報(bào)道了類(lèi)似結(jié)果。Tang等[5]利用 Mx1Cre 小鼠和 Tak1fx/fx小鼠交配得到Mx1Cre＋Tak1fx/fx小鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生 Tak1 基因敲除小鼠，研究 Tak1 基因?qū)ρ?xì)胞生成的影響，結(jié)果表現(xiàn)為骨髓和肝損傷，血細(xì)胞生成減少，凋亡增加。

本文通過(guò) siRNA 干擾技術(shù)，研究沉默 Tak1基因的表達(dá)。結(jié)果表明 siRNA 可以有效抑制 Tak1 mRNA 及蛋白的表達(dá)，抑制率可達(dá)到 88.78%。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可能缺少產(chǎn)生持續(xù)性 RNA 干擾效應(yīng)的能力，所以細(xì)胞進(jìn)行 2～4 次分裂后 RNA 干擾效應(yīng)一般會(huì)消失[6]。此外，siRNA 容易被普遍存在的 RNA 酶降解，只能維持較短時(shí)間的基因沉默作用。在本研究中 siRNA 轉(zhuǎn)染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，Tak1 基因 mRNA 水平在 48 h 達(dá)到抑制，Tak1 基因蛋白實(shí)現(xiàn)沉默效應(yīng)，因此，我們選擇在24 h 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞受 LPS 刺激細(xì)胞因子IL-1β 分泌水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果反映出 Tak1 基因在髓樣細(xì)胞中呈負(fù)性調(diào)控作用。我們實(shí)驗(yàn)觀察到Tak1 基因在髓樣細(xì)胞被沉默后，并沒(méi)有抑制 LPS激活TLR 信號(hào)通路，炎性細(xì)胞因子 IL-1β 反而升高，說(shuō)明髓樣細(xì)胞 Tak1 基因調(diào)控炎性因子的產(chǎn)生存在復(fù)雜機(jī)制。

維持和調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答對(duì)機(jī)體是非常關(guān)鍵的，正常的免疫應(yīng)答對(duì)機(jī)體能夠抵抗感染，而過(guò)度的免疫應(yīng)答會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損害。揭示 Tak1 基因在髓樣細(xì)胞中的不同于 T、B 細(xì)胞的作用規(guī)律，對(duì)深入了解免疫系統(tǒng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要的意義，可能為其分子靶點(diǎn)治療提供新的視角。

[1]Sato S, Sanjo H, Takeda K, et al.Essential function for the kinase Tak1 in innate and adaptive immune responses.Nat Immunol, 2005,6(11):1087-1095.

[2]Sato S, Sanjo H, Tsujimura T, et al.Tak1 is indispensable for development of T cells and prevention of colitis by the generation of regulatory T cells.Int Immunol, 2006, 18(10):1405-1411.

[3]Wan YY, Chi H, Xie M, et al.The kinase Tak1 integrates antigen and cytokine receptor signaling for T cell development, survival and function.Nat Immunol, 2006, 7(8):851-858.

[4]Liu HH, Xie M, Schneider MD, et al.Essential role of TAK1 in thymocyte development and activation.Proc Natl Acad Sci U S A,2006, 103(31):11677-11682.

[5]Tang M, Wei XD, Guo YS, et al.Tak1 is required for the survival of hematopoietic cells and hepatocytes in mice.J Exp Med, 2008, 205(7):1611-1619.

[6]Stein P, Svoboda P, Anger M, et al.RNAi: mammalian oocytes do it without RNA-dependent RNA polymerase.RNA, 2003, 9(2):187-192.