張俊青，吳 芹，龔其海，張 鋒，金 鳳，聶 晶，石京山

(1.遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，貴州基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563000;2.濟(jì)寧市精神病防治院，山東 濟(jì)寧 272051)

炎癥反應(yīng)在阿爾采末病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、腦缺血和中風(fēng)(stroke)等中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行變疾病的發(fā)病過程中扮演著重要的角色，甚至成為很多原發(fā)病發(fā)展的主要原因［1］。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫吞噬細(xì)胞，在致炎因素作用下被激活成反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞。激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有吞噬功能，并增加分泌細(xì)胞因子如白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)及 NO 等，這些物質(zhì)對神經(jīng)細(xì)胞有毒性作用，使神經(jīng)細(xì)胞凋亡并壞死［2－3］。

脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌內(nèi)毒素的主要成分，研究表明LPS可以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，通過細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的釋放引起炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致各種病理狀態(tài)。

石斛(Dendorbium nobile)在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中名貴中藥材。有研究表明，石斛提取物能明顯抑制LPS 誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌 IL-6、TNF-α、NO［4］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛生物總堿對原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元具有保護(hù)作用，并發(fā)現(xiàn)其在神經(jīng)藥理活性方面具有積極作用［5］。

本課題觀察了金釵石斛生物總堿對LPS誘導(dǎo)的大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，及其產(chǎn)生和釋放TNF-α、IL-6的影響及其可能的機(jī)制，利用MTS法檢測培養(yǎng)的細(xì)胞生存率;ELISA法檢測TNF-α炎性因子蛋白的表達(dá)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time RT-PCR)測定TNF-α、IL-6 mRNA水平，進(jìn)而為金釵石斛的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物清潔級(SPF級)Sprague-Dawley(SD)大鼠種鼠25只，購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證書號渝SCXK20070005)。

1.2主要試劑和藥品金釵石斛生物總堿由遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理貴州省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提取;脂多糖(批號78K4044)購于Sigma(上海)貿(mào)易有限公司;TNF-α ELISA試劑盒，上海西塘生物科技有限公司;β-actin、TNF-α、IL-6 引物、RNA 逆轉(zhuǎn)錄盒、熒光混合物購于美國ABI公司產(chǎn)品。

1.3主要儀器和設(shè)備SL SHELNB CO2孵箱為美國產(chǎn)品;IDGCJ-0.5超凈工作臺由上海先鋒電器廠制造iCycler熒光定量PCR儀為BIO-RAD美國產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄儀由德國Eppendorff制造;通用全自動酶標(biāo)儀由美國Bio-Rad公司制造。

2 方法和觀察指標(biāo)

2.1大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)的培養(yǎng)取新生3 d的SD大鼠，體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇消毒3次，無菌條件下取出大腦，將大腦皮質(zhì)放入D-Hank's液中，剪成1 mm3左右的小塊，200目篩網(wǎng)過濾。用機(jī)械吹打法逐步移取上清液中的單細(xì)胞，4℃、1500 r·min－1、10 min，棄上清液取沉淀，用含 20% 胎牛血清，100 kU·L－1青霉素和鏈霉素的DMEM制成懸液后，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×105·L－1，接種于L-多聚賴氨酸包被12 h的25 cm2培養(yǎng)瓶中，移入5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。0.5 h差速貼壁兩次后，將培養(yǎng)液移入新培養(yǎng)瓶去除成纖維細(xì)胞，靜置培養(yǎng)，3 d后換液。培養(yǎng)9～14 d待細(xì)胞融合后傳代。

2.2實(shí)驗(yàn)分組金釵石斛生物總堿實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為5組:正常組，模型組，低、中、高劑量組(0.025、0.25和2.5 mg·L－1)。準(zhǔn)確稱取脂多糖(LPS)2 mg，溶于2 ml生理鹽水中，配成1 g·L－1的母液，－20℃冰箱保存。臨用時(shí)用無胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋成終濃度為10 μg·L－1。取培養(yǎng)2～3代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞加入脂多糖作用細(xì)胞6 h，正常組加入等量的培養(yǎng)基。再分別加入不同劑量的石斛生物總堿作用24 h，取上清液檢測指標(biāo)。

2.3MTS檢測細(xì)胞的存活率用 MTS(即 MTS Reagent Powder和PMS的混合溶液)檢測細(xì)胞生存率。每孔加入100 μl含5%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行同步化培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入90 μl含不同濃度藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，最后每孔加入10 μl的MTS溶液，37℃ 95%空氣+5%CO2孵箱培養(yǎng)4 h。酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度值(absorbance，A)。

2.4ELISA法檢測TNF-α蛋白的含量星形膠質(zhì)細(xì)胞傳2～3代后進(jìn)行分組，藥物處理后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，1 500 r·min－1，4℃，離心 10 min，分裝，－80℃凍存。取上清采用TNF-α檢測試劑盒說明書所示的操作方法，用酶標(biāo)儀測定樣品在450 nm的吸光度值(A450值)。

2.5Real time RT-PCR定量分析檢測TNF-α、IL-6 mRNA的含量引物制備:分別參照GenBank基因庫中關(guān)于大鼠TNF-α、IL-6和β-actin的mRNA序列設(shè)計(jì)引物。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以±s表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較用單因素方差(one-way ANOVA)結(jié)合LSD檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1MTS檢測金釵石斛生物總堿對LPS誘導(dǎo)大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的影響模型組激活的細(xì)胞增殖率明顯高于正常組，石斛生物總堿各劑量組與模型組比較明顯降低細(xì)胞增殖率(Tab 1)。

3.2金釵石斛生物總堿對LPS誘導(dǎo)的TNF-α蛋白水平的影響模型組激活的細(xì)胞TNF-α蛋白表達(dá)上升，明顯高于正常組，石斛生物總堿各劑量組與模型組比較均下調(diào)TNF-α蛋白的表達(dá)(Tab 2)。

Tab 1 Effects of Dendrobium nobile total alkaloids on the astrocyte proliferation induced by LPS(±s，n=8)

Tab 1 Effects of Dendrobium nobile total alkaloids on the astrocyte proliferation induced by LPS(±s，n=8)

#P ＜0.05 vs control group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

＊＊

Tab 2 Effects of Dendrobium nobile total alkaloids on the level of TNF-α protein induced by LPS(±s，n=5)

Tab 2 Effects of Dendrobium nobile total alkaloids on the level of TNF-α protein induced by LPS(±s，n=5)

#P＜0.05 vs normal group;*P＜0.05 vs model group

Group TNF-α/PG/ml Normal 65.312 ±10.308 Model 98.848 ±10.792#Dendrobium nobile alkaloids(0.025 mg·L －1)81.681 ±9.255*Dendrobium nobile alkaloids(0.25 mg·L －1)80.084 ±8.587*Dendrobium nobile alkaloids(2.5 mg·L －1)75.293 ±10.703*

3.3金釵石斛生物總堿對LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α，IL-6 mRNA表達(dá)的影響模型組激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α，IL-6 mRNA表達(dá)上升，明顯高于正常組，石斛生物總堿各劑量組與模型組比較其TNF-α，IL-6 mRNA的表達(dá)明顯降低(Tab 3)。

Tab 3 Effects of Dendrobium nobile total alkaloids on LPS-induced mRNA expressions of TNF-α and IL-6(±s，n=5)

Tab 3 Effects of Dendrobium nobile total alkaloids on LPS-induced mRNA expressions of TNF-α and IL-6(±s，n=5)

#P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs model group

Group TNF-αIL-6 Normal 5.81 ±6.25 23.32 ±30.64 Model 100.00 ±12.9# 100.00 ±18.72#Dendrobium nobile alkaloids 0.025 mg·L －1 43.79 ±6.25* 32.92 ±15.73*0.25 mg·L －1 9.01 ±3.61* 32.48 ±2.75*2.5 mg·L －1 6.35 ±1.38* 26.94 ±8.28*

4 討論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥環(huán)境下，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞共同承擔(dān)著免疫細(xì)胞的角色，尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞，在很多腦部疾病中通過產(chǎn)生和釋放有害的促炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子如NO、IL-6及TNF-α等來啟動和促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)展［6］。目前神經(jīng)變性疾病的病因及發(fā)病機(jī)制尚未闡明，缺乏針對性的治療藥物，相應(yīng)的治療效果不確切，并且許多藥物長期使用后造成的毒副作用限制了其臨床應(yīng)用。因此，尋找有效防治神經(jīng)變性疾病的藥物無疑將為提高人類的生活質(zhì)量作出巨大貢獻(xiàn)，利用中草藥有效成分防治神經(jīng)變性疾病是目前國內(nèi)外新藥研發(fā)的重要方向。

本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中加入LPS，MTS值明顯增加，與隋海娟［7］研究發(fā)現(xiàn) LPS可增加星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6及TNF-α。炎癥因子TNF-α、IL-6分泌量增加，說明星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活。LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活包括形態(tài)的改變，數(shù)量的增加。星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目增加起因于星形膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖和(或)分化。炎癥介質(zhì)比如TNF-α能夠誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞分裂。增生活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元的有益或者有害作用一直存在爭論，在神經(jīng)變性疾病中，發(fā)現(xiàn)增生活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，如堿性成纖維生長因子、腦源性生長因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子以及膠質(zhì)細(xì)胞源性生長因子等，說明星形膠質(zhì)細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)及修復(fù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)LPS作用星形膠質(zhì)細(xì)胞，數(shù)量明顯增加，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元的作用是有益的。

炎癥反應(yīng)在AD的發(fā)病和進(jìn)展中起著非常重要的作用［8］。脂多糖(LPS)直接作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞可引起TNF-α和活性氧族的過量生成，產(chǎn)生炎癥和氧化應(yīng)激雙重?fù)p傷［9］。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α能夠誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，然后迅速地合成大量的TNF-α和IL-6等炎癥細(xì)胞因子，導(dǎo)致免疫炎癥損傷，Munoz-Fernandez等［10］研究發(fā)現(xiàn)激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠產(chǎn)生一氧化氮細(xì)胞毒性物質(zhì)而導(dǎo)致組織的損傷?？寡缀涂寡趸墙疴O石斛主要的藥理特性，本研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛生物總堿能明顯地減少IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)，提示石斛總堿可通過抑制炎癥通路對神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

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