孟凡麗，蘇曉田，劉發(fā)貴，鄭毅男，侯立娜

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林長春 130021;2.遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，遼寧 營口 115009)

糖尿病為一種常見病、多發(fā)病，目前我國糖尿病患者已超過4 000萬人。由糖尿病并發(fā)癥引起的死亡人數(shù)在發(fā)達國家繼心腦血管疾病、癌癥之后列第3位。糖尿病可引發(fā)白內(nèi)障、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變、腎功能不全及腎小球基底膜增厚等糖尿病慢性并發(fā)癥。大量研究證實［1－2］，糖尿病并發(fā)癥與糖代謝的多元醇通路有關(guān)，而醛糖還原酶(aldose reductase，AR)是該通路的關(guān)鍵限速酶。由糖代謝的多元醇通路激活機制發(fā)現(xiàn)，醛糖還原酶抑制劑(aldose reduetase inhibitors，ARIs)能有效抑制AR的活性，預防和延遲糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。人參皂苷是傳統(tǒng)中藥人參的主要活性成分，具有抗心肌缺血、抗腦缺氧缺血、抗衰老、抗氧化、抗疲勞、腎功能保護、降血脂和降血糖等功效［3－5］，但對于抑制糖尿病并發(fā)癥尚未見報道，本研究測定人參皂苷對AR的抑制功效，以期發(fā)現(xiàn)人參皂苷在治療糖尿病并發(fā)癥方面潛在的價值。

1 材料與方法

1.1材料、試劑與儀器人參皂苷 Re、Rd、Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rb3、Rc，購自吉林大學化學學院天然藥物化學研究室;新鮮牛眼睛由遼寧省營口市北方精制牛肉加工廠提供;DL-甘油醛和NADPH(還原型)分別購自美國Sigma公司和意大利Roth公司;牛血清白蛋白，購自北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司;考馬斯亮藍，購自天津市瑞金特色化學品有限公司;依帕司他(Epalrestat，EPS)，揚子江制藥公司。

760CRT雙光束紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司;GL-12B型高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2方法

1.2.1牛眼晶狀體中AR的分離參照Federico報道的方法［6］，稍加改良，所有步驟均在4℃以下進行。稱取300g牛晶狀體，加入3體積磷酸鹽緩沖液中用組織搗碎機搗碎;12 000 r·min－1離心20 min，取上清液緩慢加入硫酸銨至0.40飽和度，間歇攪拌1 h;再 10 000 r·min－1離心 15 min，取上清液加入硫酸銨至0.50飽和度，間歇攪拌1 h;10 000 r·min－1離心15 min，取上清液加入硫酸銨至0.75飽和度，間歇攪拌 3 h，10 000 r·min－1離心 15 min，取沉淀用少量的0.05 mol·L－1氯化鈉溶液溶解，透析12 h，即得AR粗提物，分裝，－70℃冷凍保存?zhèn)溆?。以牛血清白蛋白為對照品，采用Brad-ford染色法［7］測定AR粗提物中蛋白質(zhì)的含量。

Tab 1 Inhibitory effect of ginsenoside on AR at 100 mg·L-1concentration(±s，n=15)

Tab 1 Inhibitory effect of ginsenoside on AR at 100 mg·L-1concentration(±s，n=15)

＊＊P＜0.01 vs control

Group Rg2 Rg1 Rb1 Rb2 Rb3 Rc Rd Re EPS(control)Inhibitory rate 1.573 0.901 0.034 －0.067 －0.253 －0.094 0.782 －0.415 0.453±0.176＊＊ ±0.038＊＊ ±0.009＊＊ ±0.011 ±0.026 ±0.010 ±0.056＊＊ ±0.047 ±0.029

1.2.2人參皂苷單體對AR抑制作用的測定參照Halder等［8］的方法，測定溫度為25℃，酶反應總體積為 6 ml，包括:163 mg·L－1酶液 0.8 ml，0.8 mmol·L－1NADPH 1.0 ml，40 mmol·L－1DL-甘油醛 1.2 ml，2.0 ml的0.1 mol·L－1pH 6.2 磷酸鉀緩沖液以及不同濃度種類的人參皂苷溶液。加入底物DL－甘油醛開始反應，以340 nm處每分鐘NADPH吸光值的下降來表示AR的活性，每30 s測定1次，反應時間至少記錄3 min。陽性對照為100 mg·L－1EPS，空白對照為重蒸水。樣品對AR的抑制率按下面公式進行計算:

待測樣品對AR抑制率/%=［1－(A2－A0)/(A1－A0)］×100%

式中A0:未加醛糖還原酶、底物和樣品，即每分鐘NADPH自然吸光值的下降。

A1:未加樣品，加入醛糖還原酶、底物，每分鐘NADPH吸光值的下降。

A2:加醛糖還原酶、底物和樣品，每分鐘NADPH吸光值的下降。

以樣品濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制抑制曲線，依據(jù)動力學曲線計算其半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.3人參皂苷單體對AR抑制類型的測定選取抑制活性較高的提取物，測定其對AR的抑制類型。反應溫度為25℃，酶反應總體積3 ml，包括:163 mg·L－1酶液 0.4 ml，0.8 mmol·L－1NADPH 0.5 ml，100 mg·L－1人參皂苷 Rb1、Rd、Rg1 和 Rg2 0.5、1.0 ml，然后分別加入 40 mmol·L－1DL-甘油醛 0.75、0.375、0.25、0.188、0.15 ml啟動反應，記錄每分鐘NADPH吸光值的下降。采用雙倒數(shù)作圖法，確定抑制劑的抑制類型，根據(jù)米氏方程計算動力學常數(shù)。

1.2.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)表示為±s。

2 結(jié)果

2.1牛眼睛醛糖還原酶含量測定結(jié)果牛血清蛋白標準曲線:Y=0.1059X+0.1593，相關(guān)系數(shù):0.9991。經(jīng)定量分析測得牛眼睛 AR濃度為361.463 mg·L－1。

2.2人參皂苷對醛糖還原酶抑制作用從Tab 1可以看出在100 mg·L－1濃度時，人參皂苷 Rb2、Rb3、Rc和Re對醛糖還原酶抑制率為負值，說明他們對醛糖還原酶沒有抑制作用;而人參皂苷Rg1、Rg2、Rd和Rb1對醛糖還原酶抑制率為正值，說明他們對醛糖還原酶有抑制作用。另外從圖1看出人參皂苷Rg1、Rg2、Rd和Rb1對AR的抑制作用隨濃度的增加逐漸增強，與其濃度存在明顯的劑量－效應關(guān)系。

Tab 2是將Fig 1數(shù)據(jù)依據(jù)動力學曲線計算半數(shù)抑制濃度。結(jié)合Fig 1和Tab 2可知人參皂苷對AR的抑制，半數(shù)抑制濃度超過EPS的是人參皂苷Rb1，低于 EPS的是 Rg1、Rg2、Rd。說明人參皂苷 Rd、Rg1和Rg2對AR的抑制作用強于EPS，而Rb1的抑制作用較弱。另外根據(jù)半數(shù)抑制濃度大小，可知人參皂苷對AR抑制從高到低順序依次是人參皂苷Rg2、Rg1、Rd 和 Rb1。

Fig 1 Inhibitory effect of ginsenoside on AR

Tab 2 IC50values of ginsenoside on AR

2.3人參皂苷對AR的抑制類型選取對AR抑制活性超過EPS的人參皂苷Rd、Rg1和Rg2，采用雙倒數(shù)作圖法，測定其濃度分別為0.017和0.033 g·L－1時對AR的抑制類型，F(xiàn)ig 2可以看出，不同人參皂苷對AR的抑制作用隨著底物濃度的增大，其抑制作用隨之增強，為反競爭性抑制。

Fig 2 Inhibition type of ginsenoside on AR

3 討論

治療糖尿病并發(fā)癥的藥物中，目前市場銷售的都是合成類AR抑制劑。合成類AR抑制劑的最大問題就是毒性反應。有研究資料報道［9－11］中草藥提取物石榴皮多酚、丹參酮類化合物、黃芩苷等對AR有抑制作用，他們優(yōu)點是毒性作用較低，但通常由于其水溶性較差，且相對合成類藥物而言對AR的抑制活性較弱，因此臨床使用也受到某種程度的限制。本研究的結(jié)果表明:人參皂苷Rb1、Rd、Rg1和Rg2對AR具有抑制作用，而人參皂苷Rb2、Rb3、Rc和Re的抑制作用不明顯。半數(shù)抑制濃度的進一步分析表明，人參皂苷Rd、Rg1和Rg2對AR的抑制作用強于依帕司他，而Rb1的抑制作用較弱。說明人參皂苷Rg2、Rg1、Rd對AR具有較強的抑制作用，在糖尿病并發(fā)癥治療方面具有潛在的應用價值，而且其在治療糖尿病方面具有毒性作用低的優(yōu)點。

本研究發(fā)現(xiàn)對AR有抑制活性人參皂苷對AR抑制從高到低順序依次是人參皂苷Rg2、Rg1、Rd和Rb1，這種差異可能與其結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。下面做一下簡單分析:首先分析皂苷的種類，人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc和Rd苷元是20S－原人參二醇，人參皂苷Re、Rg1和Rg2苷元是20S－原人參三醇，從對AR抑制結(jié)果看出對AR抑制與苷元的種類無關(guān);其次分析皂苷糖鏈的的種類，雙糖鏈是人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re 和 Rg1，單糖鏈的是人參皂苷Rg2，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg2對AR抑制能力最強，說明單糖鏈皂苷對AR抑制能力強;接下來分析皂苷糖鏈上糖的種類，有兩種糖的皂苷是人參皂苷Rb2、Rb3、Rc、Re和 Rg2，有 1 種糖且是葡萄糖的是人參皂苷Rg1、Rd和Rb1，這3種皂苷對AR都有抑制作用，說明對AR的抑制與皂苷上糖鏈是否是葡萄糖有關(guān)。最后分析糖鏈葡萄糖的數(shù)量，人參皂苷Rg1糖鏈葡萄糖數(shù)量是2個，人參皂苷Rd糖鏈葡萄糖數(shù)量是3個，人參皂苷Rb1糖鏈葡萄糖數(shù)量是4個，本試驗測定的結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3種人參皂苷對AR抑制從高到底順序依次是人參皂苷 Rg1、Rd和Rb1，說明人參皂苷糖鏈上葡萄糖的數(shù)量越多，對AR的抑制能力越差，故對AR的抑制與皂苷上葡萄糖的數(shù)量有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg2、Rg1、Rd對AR的抑制作用均為反競爭性抑制，而EPS是一種可逆性非競爭型的醛糖還原酶抑制劑［12］。正常狀態(tài)時體內(nèi)葡萄糖主要經(jīng)糖酵解通路后進入有氧或無氧途徑進一步代謝，多元醇通路只是起到補充作用，在糖尿病高血糖狀態(tài)時，糖酵解達到極限，多元醇通路的代謝明顯加強，在正常情況下，細胞內(nèi)的葡萄糖僅約5%進入多元醇通路，糖尿病狀態(tài)下，該通路異常激活，約30%的葡萄糖進入此通路，多元醇通路的異常激活是糖尿病慢性并發(fā)癥的重要發(fā)病機制之一。EPS作為ARI，可以特異性地阻斷多元醇通路，有效干預糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。而人參皂苷Rg2、Rg1、Rd抑制糖尿病并發(fā)癥的作用機制是否跟EPS一樣，其它人參皂苷是否具有抑制醛糖還原酶活性有待進一步研究。

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