張亞宏，甘 瑩，郭子華，謝松強(qiáng)

(1.河南大學(xué)天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南開封 475004;2.開封市中醫(yī)院腦病科，河南開封 475000)

紫草素(shikonin)是從紫草科植物紫草的根中提取出的一種有效成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為萘醌類化合物，具有抗炎、抗腫瘤等作用［1－2］。文獻(xiàn)報(bào)道可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，但是其凋亡機(jī)制還不甚明了［3－4］。ROS是生物體有氧代謝過程中產(chǎn)生的一類活性含氧化合物的總稱，其在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用［5－6］。本文選用人宮頸癌HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象，研究shikonin對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，并探討其機(jī)制是否與ROS有關(guān)。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑紫草素(shikonin)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;應(yīng)用時(shí)用二甲基亞砜(DMSO)溶解，并使DMSO的終濃度低于0.01 g·L－1。甲基噻唑藍(lán)(MTT)、DMSO、碘化丙啶 (PI)和RNase A均購(gòu)于美國(guó) Sigma公司;p38MAPK 抑制劑(SB203580)購(gòu)于美國(guó)Calbiochem公司。caspase-3、p-p38及β-actin的單克隆抗體及辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗購(gòu)于Santa Cruz Biotechnology公司。RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco，USA)，胎牛血清為北京元亨圣馬生物試劑公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)A-merican Type Culture Collection(ATCC)。細(xì)胞單層接種在含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，以每孔1.5×104個(gè)細(xì)胞埋入96孔板。培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的shikonin;或在加入不同濃度抑制劑 1 h 后，加入35 μmol·L－1的 shikonin。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至不同時(shí)間點(diǎn)，每孔加入5 g·L－1MTT 10 μl再培養(yǎng)3 h后，吸棄上清液，每孔加入 150 μl DMSO溶解，于酶標(biāo)儀492 nm下測(cè)定各孔吸光值(A值)，根據(jù)以下公式計(jì)算抑制率:

1.4細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察以每孔5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后加入濃度為0和35 μmol·L－1的 shikonin，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.5流式細(xì)胞儀分析ROS的產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡率［6－7］以每瓶1×106個(gè)細(xì)胞分瓶，24 h后在加入不同濃度抑制劑后，加入 35 μmol·L－1的 shikonin，作用相應(yīng)的時(shí)間。收集細(xì)胞，用PBS清洗1次。若觀察 ROS 的產(chǎn)生，則加入 10 μmol·L－1的 DCF-DA孵育45 min后上機(jī)分析。若觀察細(xì)胞凋亡的變化，則用70%乙醇固定過夜。次日將單細(xì)胞懸液離心棄去固定液，用PBS洗滌1～2次，加入50 mg·L－1(0.1 g·L－1RNase，PBS 配制)PI染色液 1.0 ml，置4℃避光染色1 h后上流式細(xì)胞儀分析，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DNA分布情況。

1.6Western blot分析蛋白的表達(dá)［6］以每瓶1×106個(gè)細(xì)胞分瓶，24 h 后加入 35 μmol·L－1的 shikonin，或在加入5 mmol·L－1NAC 1 h 后加入35 μmol·L－1的shikonin，作用相應(yīng)的時(shí)間。收集細(xì)胞，用100 μl細(xì)胞裂解液冰浴裂解1 h，15 000×g離心5 min，收集上清。經(jīng)Bio-Rad法進(jìn)行蛋白定量后以12%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，50 g·L－1脫脂奶粉封閉后，一抗封閉過夜，再以辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗封閉液封閉2 h，以二氨基聯(lián)苯胺溶液顯色，掃描記錄。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析如無特殊提示，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均得自3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)用±s表示，用SPSS 13.0軟件中的ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。

2 結(jié)果

2.1Shikonin誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的作用Shikonin可時(shí)間和劑量依賴性的誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生生長(zhǎng)抑制。如 Fig 1A 所示:10 到 100 μmol·L－1shikonin對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)具有不同程度的抑制作用。其在6、12、24和36 h的 IC50值分別是104.9，74.9，33.8 和 29.1 μmol·L－1。在24 h 時(shí)，35 μmol·L－1shikonin可誘導(dǎo)明顯的生長(zhǎng)抑制，因此，選用其為以下研究的濃度。35 μmol·L－1shikonin作用于HeLa細(xì)胞24 h后，細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞皺縮、變圓，并出芽形成明顯的凋亡小體(Fig 1B)。此外，35 μmol·L－1shikonin 作用于細(xì)胞 6、12、24 h后，caspase-3前體procaspase-3的表達(dá)時(shí)間依賴性的減少(Fig 1C)。

2.2Shikonin誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞ROS的產(chǎn)生ROS的探針DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，在胞內(nèi)可以被酯酶水解生成DCFH，DCFH不能通透細(xì)胞膜，其在細(xì)胞內(nèi)的ROS的作用下被氧化生成有熒光的DCF，其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平成正比。如 Fig 2 所示，35 μmol·L－1shikonin作用于HeLa細(xì)胞12 h及24 h后，均可以誘導(dǎo)大量ROS的產(chǎn)生。

2.3ROS和p38對(duì)shikonin誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的影響加入活性氧的清除劑5 mmol·L－1NAC及10 μmol·L－1p38 MAPK 的特異性抑制劑 SB203580后，由shikonin誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及凋亡率均明顯降低，而單獨(dú)加入 NAC或 SB203580對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率及凋亡率均沒有明顯的影響(Fig 3)。

2.4ROS對(duì)shikonin誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞caspase-3及p-p38蛋白表達(dá)的影響如 Fig 4所示，35 μmol·L－1shikonin作用于HeLa細(xì)胞24 h后，可以誘導(dǎo)procaspase-3表達(dá)降低并可以明顯增加p38活性形式p-p38的表達(dá);加入NAC后，下調(diào)的procaspase-3及上調(diào)的p-p38均有所逆轉(zhuǎn);而與對(duì)照組相比單獨(dú)加入NAC對(duì)上述蛋白的表達(dá)均未有影響。

Fig 1 Shikonin induces apoptosis in HeLa cells

Fig 2 ROS is induced by shikonin in HeLa cells.

Fig 3 Effects of ROS and p38 on shikonin-induced apoptosis in He-La cells(±s，n=3).

Fig 4 Effect of NAC on the protein expression of procaspase-3 and p-p38 in shikonin-treated HeLa cells.

3 討論

近些年來，天然藥物在腫瘤治療的過程中發(fā)揮著重要的作用，目前發(fā)現(xiàn)許多天然藥物單體化合物如紫杉醇、苦參堿等都具有較好的抗腫瘤作用［8］;因此，對(duì)天然藥物抗腫瘤作用靶點(diǎn)的尋找及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究對(duì)腫瘤的治療和天然藥物的發(fā)展都至關(guān)重要。Shikonin是從天然藥物紫草中提取出的萘醌類化合物，其具有較好的體外抗腫瘤活性［2－4］，在此我們進(jìn)一步研究了其誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞死亡的機(jī)制。

Shikonin時(shí)間劑量依賴性的抑制HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)，倒置顯微鏡下觀察到其可以使細(xì)胞浮起、變圓，并出芽形成凋亡小體，而procaspase-3的表達(dá)亦隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)減少。Caspase家族——半胱氨酸蛋白酶為一類與凋亡密切相關(guān)的酶類，其在凋亡的進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要的作用;其中凋亡效應(yīng)子的caspase-3被認(rèn)為是凋亡的標(biāo)志之一［9］。在凋亡過程中，caspase-3被激活則其前體procaspase-3表達(dá)量必然減少。由結(jié)果可以看出shikonin明顯的誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生了凋亡。

ROS在細(xì)胞的各種生命進(jìn)程中都發(fā)揮著重要的作用，其可作為第二信使調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及自噬相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［5－6，10］。在此，我們考察了ROS在shikonin誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡中的作用。Shikonin可以誘導(dǎo) ROS的產(chǎn)生，清除了ROS后，shikonin所引起的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡均被抑制，而由shikonin引起的procaspase-3表達(dá)的減少亦被逆轉(zhuǎn)，證明ROS在shikonin誘導(dǎo)的凋亡中發(fā)揮著重要的作用。有研究表明［11］，水飛薊賓可以通過激活ROS/p38信號(hào)通路誘導(dǎo)HT1080細(xì)胞死亡。p38激酶是有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的一員，其在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用［12］。因此，我們探討了p38在此凋亡中的作用。加入p38特異性抑制劑SB203580后，與加入NAC結(jié)果一致，shikonin所引起的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡均被抑制;而加入shikonin后，p-p38表達(dá)明顯增加，表明p38被激活，證明shikonin通過激活p38而誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，即p38亦參與了shikonin誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞的凋亡過程。隨后，再加入NAC預(yù)處理后，p-p38的表達(dá)與的單獨(dú)加shikonin組相比有明顯的降低，表明在此過程中ROS是通過調(diào)節(jié)p38的活性來誘導(dǎo)凋亡的。

由此可以得出結(jié)論，shikonin通過誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，既而激活p38而介導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。

［1］Tanaka S，Tajima M，Tsukada M，Tabata M.A comparative study on anti-inflammatory activities of the enantiomers，shikonin and alkannin［J］.J Nat Prod，1986，49(3):466 －9.

［2］Mao X，Yu C R，Li W H，Li W X.Induction of apoptosis by shikonin through a ROS/JNKmediated process in Bcr/Abl-positive chronic myelogenous leukemia(CML)cells［J］.Cell Res，2008，18(8):879－88.

［3］吳 振，吳立軍，田代真一，等.紫草素誘導(dǎo)A375-S2細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2005，21(2):202－5.

［3］Wu Z，Wu L J，TASHIRO S I，et al.Studies on the mechanisms of shikonin-induced A375-S2 cell apoptosis［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，21(2):202 －5.

［4］Han W D，Li L，Qiu S，et al.Shikonin circumvents cancer drug resistance by induction of a necroptotic death［J］.Mol Cancer T-her，2007，6(5):1641 －9.

［5］Liu B，Cheng Y，Zhang B，et al.Polygonatum cyrtonema lectin induces apoptosis and autophagy in human melanoma A375 cells through a mitochondria-mediated ROS-p38-p53 pathway［J］.Cancer Lett，2008，275(1):54 －60.

［6］Yang J，Wu J N，Tashiro S，et al.Critical roles of reactive oxygen species in mitochondrial permeability transition in mediating evodiamine-induced human melanoma A375-S2 cell apoptosis［J］.FreeRadic Res，2007，41(10):1099 －108.

［7］Hotz M A，Delbino G.Cytosatic and cytotoxic effects of FST on human promyelocytic HL-60 and lymphcytic molt-4 leukemic cells［J］.Cancer Res，1992，52(6):1530 －5.

［8］郭啟帥，黃 曦，李少林.苦參堿誘導(dǎo)卵巢癌SKOV_3細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(8):1104－7.

［8］Guo Q S，Huang X，Li S L.Effects of matrine on apoptosis of human ovarian cancer cell line SKOV_3 and its mechanism［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(8):1104 －7.

［9］Nicholson D W.Caspase structure，proteolytic sub-strates，and function during apoptotic cell death［J］.Cell Death Differ，1999，6(11):1028.

［10］Mojgan D M，Maneulla A，Julie M.Regulation of autophagy by NF-κB transcription factor and reactives oxygen species［J］.Autophagy，2007，3(4):390 －2.

［11］Duan W J，Li Q S，Xia M Y，et al.Silibinin activated ROS-p38-NF-κB positive feedback and induced autophagic death in human fibrosarcoma HT1080 cells［J］.J Asian Nat Prod Res，2011，13(1):27－35.

［12］Suzuki K，Hino M，Kutsuna H，et al.Selective activation of p38 mitogen-activated protein kinase cascade in human neutrophils stimulated by IL-1 beta［J］.J Immunol，2001，167(10):5940 －7.