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      內(nèi)嗎啡肽對小鼠樹突狀細胞免疫功能的影響

      2011-06-09 02:11:12李正紅方迎艷楊麗娟
      中國藥理學通報 2011年7期
      關鍵詞:阿片樹突嗎啡

      李正紅,于 影,楊 銳,方迎艷,楊麗娟,高 琴

      (蚌埠醫(yī)學院生理學教研室,安徽蚌埠 233030)

      內(nèi)嗎啡肽(endomorphins,EMs)是新發(fā)現(xiàn)的一種阿片樣四肽。EMs有兩種:內(nèi)嗎啡肽-1(EM-1)和內(nèi)嗎啡肽-2(EM-2)。它們有特異性的結構,對Mu阿片受體有很高的親和力,被認為是Mu阿片受體的內(nèi)源性配體[1]。EM-1和EM-2不僅參與鎮(zhèn)痛、心血管、胃腸、內(nèi)分泌等功能的調(diào)節(jié),也參與對免疫功能的調(diào)節(jié)[2]。EM-1和EM-2在巨噬細胞/單核細胞中被檢測到[3],它們可改變腹腔巨噬細胞的功能[4-6],包括抑制巨噬細胞的趨化性和超氧負離子的產(chǎn)生等。

      樹突狀細胞(dendritic cells,DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強大的專職抗原遞呈細胞(antigen presenting cells,APC),也是唯一能激活初始性T細胞的APC。DC的功能特點與其成熟狀態(tài)密切相關,未成熟DC表達低水平的協(xié)同刺激分子和黏附分子,誘導T細胞的能力較弱,但是具有極強的吞噬和加工處理抗原能力。成熟DC細胞表面MHC-Ⅱ分子和協(xié)同刺激分子表達增加,其呈遞抗原的能力增強,可與T細胞相互作用啟動免疫應答。

      既然DC是功能最強大的APC,并且有文獻報道在人、鼠 DC可表達 Mu阿片受體[7],但 EMs對DC免疫功能的調(diào)節(jié)尚未見報道。本研究觀察EMs對LPS活化DC過程中細胞表型、趨化性和T淋巴細胞增殖能力改變的影響,以期進一步揭示內(nèi)嗎啡肽的免疫調(diào)節(jié)作用。

      1 材料與方法

      1.1材料

      1.1.1藥品與試劑鼠源集落刺激因子(Pepro-Tech,Rocky Hill,NJ);CD11+磁珠(Miltenyi Biotech,Bergish-Gladbach,Germany);PE標記的DC特定的表面分子,如MHC classⅡ、CD11c、CD80、CD86購自 BD-Pharmingen。LPS(lipopolysacchairde,脂多糖)購自 Sigma Aldrich。CTOP(25 μmol·L-1,Mu阿片受體特異性拮抗劑,Sigma,MI)。T細胞尼龍毛柱購自伊普瑞斯科技有限公司。[3H]胸腺嘧啶核苷購自北京原子能研究所。

      1.1.2實驗動物C57BL/6J♀鼠,體質量18~22 g,購自北京協(xié)和醫(yī)科大學實驗動物研究所。

      1.2方法

      1.2.1骨髓來源的DC的制備與培養(yǎng)用 Inaba等[8]的方法來培養(yǎng)大量的DC,略作改動。將7~8周齡的正常C57BL/6J鼠頸椎脫位處死,無菌條件下取完整的股骨、脛骨,剔凈周圍組織,離斷干骺端后,用皮試針抽吸RPMI 1640培養(yǎng)液沖洗髓腔,獲得單細胞懸液;1 500 r·min-1離心10 min,棄上清后加入適量Tris-NH4Cl破解紅細胞,再用PBS洗滌兩次后用含10 μg·L-1GM-CSF、10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細胞,種于6孔板,接種密度為1 ×109·L-1~2 ×109·L-1、3 ~4 ml·well-1。d 3,輕輕吸棄未貼壁細胞、全量換液。d 5,吸棄半量培養(yǎng)基,并補充該量。d 6、d 7,收集懸浮和半貼壁細胞。

      采用CD11c免疫磁珠進行磁性分選純化DC。用20 mmol·L-1PBS洗滌細胞兩次,加入CD11c免疫磁珠,4℃反應20 min,離心洗滌后將細胞懸液加入MS磁分離柱中進行分離純化,獲取CD11c+的骨髓來源的樹突狀細胞,所有操作根據(jù)autoMACS系統(tǒng)的廠商說明書進行。采用PE標記的倉鼠抗小鼠CD11c mAb,通過流式細胞儀(florescence-activated cell sorting,F(xiàn)ACS)分析純化前后的DC純度。

      1.2.2DC表面分子的檢測流式細胞儀用于DC細胞表型分析。LPS激活的DC加入不同濃度的EM-1/EM-2,活化的DC不加入EMs用作對照。經(jīng)過48h的培養(yǎng),分析DC的表型,DC分別與下列抗體在 4℃ 孵育:CD11c、CD80、CD86 和 MHC classⅡ,20 min后,清洗3次,細胞經(jīng)流式細胞儀分析。

      1.2.3DC趨化性實驗利用96 transwell趨化小室(Chemo TX system,Neuro Probe,MD,USA)和聚碳酸酯濾器(孔徑5 μm)檢測DC細胞遷移能力。DC的成熟需要 LPS(1 mg·L-1)培養(yǎng) 24 h。成熟的 DC 以 5 × 108·L-1的數(shù)目用 15 μmol·L-1Carboxy Fluoroscein Succinimidyl Ester(CFSE)(Invitrogen,CA,USA)標記20 min,然后沖洗2次。上層的隔室用有DC的200 μl細胞懸液RPMI 1640培養(yǎng)基,其中含有多種濃度的EM-1或-2,下層用含有 200 μg·L-1的趨化因子 CCL2、CCL3 和 CCL21(PeproTech)的0.5ml的培養(yǎng)基來填充。CTOP(25 μmol·L-1),是Mu阿片受體的特異性拮抗劑,在內(nèi)嗎啡肽(10-6mol·L-1)添加30 min之前加入到上室。每種條件設置3個平行實驗。完整的小室放置在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90 min。培養(yǎng)之后,移除上層小室的細胞懸液,通過過濾器由上層遷移至下層小室的細胞可以用流式細胞儀完全計數(shù)。用下層小室中CSFE標記的DC的平均熒光強度(MFI)來表示結果。

      1.2.4T淋巴細胞增殖反應的檢測采用3H-TdR參入法。取正常C57/BL6小鼠脾臟,制備無菌的脾細胞懸液,以完全培養(yǎng)基懸浮,注入T細胞尼龍毛柱,置37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)1 h,沖出非黏附的細胞作為反應細胞(即純化的T細胞),調(diào)節(jié)細胞濃度至 1 ×109·L-1,加入 96 孔圓底培養(yǎng)板,100 μl/孔;與此同時,培養(yǎng)7 d的DC經(jīng)LPS刺激24 h,加入不同濃度的 EMs,或 CTOP 和 10-6mol·L-1的 EMs。處理的DC(5 000個)與105純化的T細胞混合,并繼續(xù)培養(yǎng)72 h,加入1.85×104Bq[3H]胸腺嘧啶核苷(thymidine),繼續(xù)培養(yǎng)18 h。收集細胞,液閃計數(shù)儀檢測cpm值,結果以3孔平均值表示。

      1.3統(tǒng)計學分析Mann-Whitney U test用于比較不同試驗組的不同。

      2 結果

      2.1EMs對DC表面分子表達的影響流式細胞儀的分析結果表明,CD11c陽性細胞純度達95%以上。當用LPS刺激DC24h,細胞表面分子的表達上調(diào)。

      LPS激活的DC加入不同濃度的EM-1/EM-2(10-6、10-8和 10-10mol·L-1),活化的 DC 不加入EM-1/EM-2用作對照。經(jīng)過48 h的培養(yǎng),檢測DC表面分子的變化。結果表明,DC的表面膜分子MHC classⅡ、CD80和CD86,與LPS活化的DC組相比,沒有明顯的改變(Tab 1,EM-1/EM-2 10-8mol·L-1和 10-10mol·L-1的結果也是沒有明顯的改變,數(shù)據(jù)未列出)。

      Tab 1 Expression levels of surface molecules in DCs(±s,%,)

      Tab 1 Expression levels of surface molecules in DCs(±s,%,)

      imDC:Immature DCs;LPS:DCs cultured in the presense of LPS;**P <0.01 vs imDC

      Group MHC classⅡCD86 CD80 imDC 20.3 ±3.6 16.8 ±3.5 24.9 ±5.3 LPS 57.0 ±4.8** 62.8 ±6.7** 77.7 ±8.2**LPS+EM-1(10 -6mol·L -1)52.4 ±6.1 64.2 ±6.8 76.7 ±9.1 LPS+EM-2(10 -6mol·L -1)53.9 ±4.4 61.4 ±7.8 75.5 ±6.4

      2.2EMs抑制DC的趨化性為了證明EMs是否影響DC的趨化性,幾種細胞因子包括CCL2、CCL3和CCL21被放置在小室的底部作為化學引誘物。CSFE-標記的 DC孵育在含有多種濃度EM-1/EM-2的上層孔室中,遷移到底部的DC的熒光強度可作為內(nèi)嗎啡肽對DC趨化性的抑制能力的評價。結果顯示 EM-1 在濃度為10-6mol·L-1,EM-2 在濃度為10-7mol·L-1時,可以抑制 DC 的趨化性。預先CTOP處理,可以阻止這些內(nèi)嗎啡肽的抑制能力(Fig 1)。

      2.3EMs處理的DC影響T淋巴細胞增殖反應DC的一個重要的功能就是指導T淋巴細胞的活化和增殖,引導獲得性免疫的發(fā)展。由于T淋巴細胞可以表達Mu受體[9],因此為了排除T細胞上的效應,DC預先用LPS和多種濃度的激動劑EM-1和EM-2共孵育24h,然后用PBS洗去LPS和EMs。沖洗過的DC和同種基因型的T淋巴細胞共培養(yǎng)3 d。用3H-胸腺嘧啶核苷的參入來反映T淋巴細胞的增殖。如Fig 2所示,EM-1(10-6mol·L-1)或 EM-2(10-8和 10-6mol·L-1)處理的樹突狀細胞在與 T淋巴細胞共培養(yǎng)時,T淋巴細胞的增殖呈現(xiàn)出濃度依賴性的抑制。EM-1(10-6mol·L-1)和 EM-2(>10-8mol·L-1)明顯地降低了細胞增殖的程度。CTOP預處理樹突狀細胞,T淋巴細胞的增殖反應不再降低,表現(xiàn)出與LPS活化的樹突狀細胞相似的增殖效果。實驗結果說明,經(jīng)EMs處理過的DC能抑制T淋巴細胞的增殖,這種抑制效應是由Mu受體介導的(Fig 2)。

      3 討論

      EM-1和EM-2,作為內(nèi)源性阿片類物質家族的一員,在1997年被Zadina等[1]發(fā)現(xiàn)。免疫細胞釋放的類阿片活性肽不僅可以作用在神經(jīng)元的阿片樣受體[10],也可以作為有力的細胞內(nèi)免疫應答的調(diào)控子影響免疫系統(tǒng)[11,20],這表明了通過類阿片活性肽和它們的受體可以進行雙向的阿片能的神經(jīng)免疫相互作用。近年來,越來越多的證據(jù)表明,EM-1和EM-2不僅參與炎癥反應[12-13],而且它們可通過改變細胞因子的產(chǎn)生,來改變腹腔巨噬細胞的功能[4-6]。DC和巨噬細胞相似,都屬于抗原提呈細胞,并且有文獻報道在人、鼠DC可表達Mu阿片受體[7],而且我們以往的實驗也發(fā)現(xiàn)EM-1和EM-2在樹突狀細胞可誘導性表達[14]。但是,目前關于EMs對DC的調(diào)節(jié)作用尚未見相關報道。

      Fig 1 Endomorphin-1 and endomorphin-2 inhibit DCs chemotaxis

      DC是最有效的抗原提呈細胞,在激活靜止的T細胞和啟動T細胞依賴的免疫應答中起特殊作用[19]。未成熟DC在攝取抗原或接受到某些刺激因素(如 LPS、TNF-α)后,細胞表面 MHC-Ⅱ分子和協(xié)同刺激分子表達增加,逐漸分化成熟,并同時向淋巴器官遷移。成熟DC在其表面將加工處理的抗原肽/MHC復合物呈遞給T細胞,與T細胞相互作用發(fā)生免疫應答,該過程還需要協(xié)同刺激分子的參與,其中,最重要的是T細胞表面CD28與DC表面相應配體CD80和CD86的結合。因此,DC的成熟狀態(tài)關系到能否激發(fā)有效的獲得性免疫應答。本研究也證明了LPS激活DC后,其表面分子MHC classⅡ、CD80和 CD86表達增加,但是加入不同濃度的EM-1/EM-2共培養(yǎng)后,DC表面分子的表達沒有明顯改變,提示EMs可能不影響DC的表型分子表達。

      Fig 2 Treatment by EM-1 or EM-2 impair the T cell stimulatory capacity of mDC

      DC啟動免疫反應的能力取決于它們特異的游走和向組織匯集的特點。DC可以有效的找到淋巴器官中T細胞區(qū)域,并與T細胞發(fā)生相互作用。在免疫應答的發(fā)展中,DC趨化性的調(diào)節(jié)起到重要的作用。有文獻報道了嗎啡可以抑制單核細胞的趨化性,支持了在單核細胞趨化性中Mu阿片受體和嗎啡的調(diào)控作用[15]。近來的許多研究[12]也表明EM-1和EM-2可以抑制巨噬細胞的趨化性,并且具有抗炎作用。在本研究中,我們觀察到EM-1和EM-2可以抑制DC的趨化性,并且這種抑制作用可以被Mu阿片受體的特異性拮抗劑CTOP逆轉。我們的研究與EM-1和-2可以參與炎癥反應或起始刺激的證據(jù)是一致的[16]。

      DC的一個重要的功能就是指導T淋巴細胞的活化和增殖,引導獲得性免疫的發(fā)展。由阿片肽引起的DC功能的變化,可以通過T細胞增殖來體現(xiàn)。本實驗,我們首次報道EMs處理后的DC對T細胞增殖具有抑制效應。這樣的抑制效應可以歸結為在內(nèi)嗎啡肽處理后的DC中,抗炎的細胞因子IL-10的生成增加,和 IL-12、IL-23 的生成減少[17]。IL-12 主要由DC等在活化過程中產(chǎn)生、分泌,具有激活NK細胞、促進T細胞增殖、促進輔助性T細胞(T helper,Th)分化為 Th1 型細胞的作用[18]。

      本實驗結果表明,雖然EM-1和EM-2不影響DC表面分子的表達,但是EM-1和EM-2抑制DC的趨化性,抑制了DC對T淋巴細胞的增殖能力,提示EM-1和EM-2可能抑制了DC對T淋巴細胞的激活作用。推測M-1和EM-2可以通過影響DC、巨噬細胞等的免疫功能,調(diào)節(jié)先天的和適應性的免疫應答。

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