白文婷

腦缺血再灌注后以神經(jīng)元為主的壞死和細(xì)胞凋亡是缺血性腦損傷中重要的病理生理過程,其中細(xì)胞凋亡的重要作用越來越受到人們重視。導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的通路有多條,其中Fas和FasL系統(tǒng)是細(xì)胞凋亡中最重要的途徑之一[1,2]。巴曲酶是目前比較公認(rèn)的治療缺血性腦血管病的藥物之一,本研究從基因表達(dá)角度觀察巴曲酶對腦缺血再灌注損傷后Fas、FasL基因較表達(dá)水平的影響,為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立與分組 選用健康W ister大鼠40只,雌雄不拘,體質(zhì)量200～250 g,由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,并隨機(jī)分為5組,即Ⅰ組為假手術(shù)組,Ⅱa組為等滲鹽水缺血6 h組,Ⅱb為等滲鹽水缺血6 h再灌注6 h組(分別于缺血后2 h予以腹腔注射0.9%生理鹽水1 m l),Ⅲa組為巴曲酶缺血6 h組,Ⅲb組為巴曲酶缺血6 h再灌注6 h組[與生理鹽水組同時(shí)間同途徑注射巴曲酶注射液8 BU/kg(用生理鹽水衡釋為1 m l)],每組各8只。模型的建立參照Zez-Longe法[3,4]并改良,大鼠麻醉后分離結(jié)扎右側(cè)頸總動脈、頸外動脈,頸內(nèi)動脈放置動脈夾,在近動脈分叉處約5 mm剪一小口,用直徑0.17 mm的尼龍線(頭端膨大直徑約為0.25mm)插入頸內(nèi)動脈約(19.0±0.5)mm,遇阻即止,閉塞大鼠清醒后爬行時(shí)向左轉(zhuǎn)圈或提尾時(shí)左前肢內(nèi)收屈曲為入組標(biāo)準(zhǔn)。每組大鼠于規(guī)定時(shí)間點(diǎn)快速斷頭取腦,剝?nèi)∮覀?cè)大腦額頂葉上部皮質(zhì),液氮中凍存。

1.2 RT-PCR法半定量Fas m RNA和FasLm RNA表達(dá)水平

1.2.1 總RNA提取 取上述樣本放入1‰DEPC處理的研缽中充分研磨后,加入 1m l Trizol試劑(美國Invitrogen),按說明書提取組織的總RNA。在質(zhì)量濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳,檢測RNA完整性。以 Pharmacia Biotech Gene QuantⅡ紫外分光光度計(jì)測量總RNA在260 nm和280 nm時(shí)的吸光度比值A(chǔ) 260/A 280。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄 取1μl總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega),應(yīng)用PEK IN ELMER 480DNA擴(kuò)增儀進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng) 引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成,FasmRNA 的引物序列為 5＇-GCAATGCTTCTCTCTGTGACCACTG-3＇(上游),5＇-GCTGTTGTGCTCGATCTCA TCG-3＇(下游),產(chǎn)物長度為347 bp;FasLm RNA 的 引物 序列 為 5＇-ATAGAGCTGTGGCTACCGGT-3＇(上游),5＇-CTCCAGAGATCAAAGCAGTTCC-3＇(下游),產(chǎn)物長度為285 bp;β-actin 為內(nèi)參照 ,引物序列 為 5＇-TTGTA-ACCAACTGGGACGATATGG-3＇(上 游),5＇-GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG-3＇(下游),產(chǎn)物長度為760 bp。PCR反應(yīng)總體積為25μl,反應(yīng)條件為Fasm RNA;94℃預(yù)變性5 min;循環(huán)參數(shù)：94℃變性40 s,61℃退火1 min,72℃延伸1 min,共28個循環(huán);最后72℃延伸 7 m in;FasLm RNA：94℃預(yù)變性5min;循環(huán)參數(shù)：94℃變性40 s,63℃退火1m in,72℃延伸1m in,共28個循環(huán);最后 72 ℃延伸 7 m in;β-actin：94 ℃預(yù)變性 5 m in;循環(huán)參數(shù)：94℃變性40 s,55℃退火40 s,72℃延伸40 s,共 30個循環(huán);最后72 ℃延伸7 min.取 5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量濃度為20 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/L溴乙錠)電泳,電壓5 V/cm,在 WD-9403紫外線攝影儀上攝影記錄。用TotalLab軟件進(jìn)行吸光度容積定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

缺血半暗帶組織Fasm RNA、FasLm RNA的表達(dá)水平：Ⅰ組FasmRNA、FasLm RNA均未見表達(dá),Ⅱa及Ⅱb組表達(dá)水平明顯增高,Ⅲa及Ⅲb表達(dá)水平明顯下降(圖 1、2),擴(kuò)增片段分別為347 bp、285 bp、RT-PCR半定量光密度比值(Fas/β-actin m RNA 、FasL/β-actinm RA)見表 1 。

圖1 各組FasmRNA RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 各組FasLmRNA RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

表1 各組腦組織缺血半暗帶皮質(zhì)Fasm RNA、FasLmRNA 表達(dá)水平(±s,n=8)

表1 各組腦組織缺血半暗帶皮質(zhì)Fasm RNA、FasLmRNA 表達(dá)水平(±s,n=8)

注：與Ⅲa及Ⅱb組比較,*P＜0.01

組別 Fas/β-actin mRNA FasL/β-actin mRNAⅡa組 0.90±0.05 0.45±0.02Ⅱb組 0.94±0.06 0.51±0.03Ⅲa組 0.45±0.03* 0.22±0.03*Ⅲb組 0.40±0.06* 0.16±0.01*

3 討 論

Fas又稱Apo-1或CD95,是一個 45 kd的Ⅰ型膜蛋白,屬于TNF和NGF受體超家族。Fas具有1個跨膜結(jié)構(gòu),C末端位于細(xì)胞外,具有3個富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域;細(xì)胞內(nèi)存在一個誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所必須的特殊結(jié)構(gòu)——凋亡結(jié)構(gòu)域[5,6]。Fas配體(FasL)是一個40 kd的Ⅱ型跨膜糖蛋白,屬TNF家庭成員。成年哺乳動物正常大腦檢測不到Fas基因表達(dá)信號,而腦缺血誘發(fā)Fas基因表達(dá)。本研究結(jié)果顯示,大鼠腦缺血再灌注后 Fasm RNA和FasLmRNA的表達(dá)水平均明顯增高,這表明腦缺血再灌注的確可誘導(dǎo)FasmRNA、FasLmRNA在腦中表達(dá)。Fas與活化細(xì)胞交聯(lián)誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制主要是細(xì)胞內(nèi)酷氨酸和絲/蘇氨酸的磷酸化。凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過Fas與FasL結(jié)合,誘導(dǎo)神經(jīng)鞘磷脂酶Smase的活化,分解SM生成神經(jīng)酰胺(CM),CM通過膜結(jié)合性的絲/蘇氨酸蛋白激酶等激活第二信使途徑,使胞內(nèi)鈣離子濃度升高引發(fā)一系列的生化反應(yīng),從而誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。腦缺血后細(xì)包凋亡發(fā)生的機(jī)制尚不完全清楚,既是凋亡相關(guān)基因表達(dá)的結(jié)果,又受其他許多內(nèi)外因素調(diào)節(jié)。Fas參與腦缺血后凋亡的機(jī)制可能是缺血性腦損傷后Fas和FasL均表達(dá),在原位直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;表達(dá)Fas血細(xì)胞通過血-腦屏障與表達(dá)FasL的神經(jīng)細(xì)胞相遇,或表達(dá)FasL的血細(xì)胞與表達(dá)Fas的神經(jīng)細(xì)胞相遇,將造成神經(jīng)細(xì)胞的死亡;可能其他細(xì)胞因子可以上調(diào)Fas的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程?？傊?這其中的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

巴曲酶(DF-521)是由生物合成的一種高純度類凝血酶樣物質(zhì),屬于糖蛋白,其肽鏈由231個氨基酸組成,分子量36000,是目前比較公認(rèn)的治療缺血性腦血管病的藥物之一,如降低纖維蛋白原含量、改善循環(huán)等,DF-521還具有減少缺血性腦血管病后的神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡數(shù)量、多層次多途徑的神經(jīng)保護(hù)作用[7,8]。巴曲酶能否通過抑制腦缺血再灌注后FasRNA和FasLm RNA表達(dá)來減少細(xì)胞壞死和凋亡而起到腦保護(hù)作用呢?本試驗(yàn)結(jié)果顯示Ⅱa及Ⅱb組表達(dá)水平明顯增高,Ⅲa及Ⅲb組表達(dá)水平明顯下降,并且兩組相比有顯著差異(P＜0.01)。因此,本研究認(rèn)為巴曲酶對Fasm RNA和FasLm RNA表達(dá)有抑制作用,也就是說它有可能通過抑制Fasm RNA和FasLm RNA表達(dá)而起到腦保護(hù)作用,這其中的詳細(xì)作用機(jī)制還不十分清楚,有待進(jìn)一步研究。

1 魏家臣.Fas/FasL介導(dǎo)凋亡細(xì)胞機(jī)制及其病理生理意義.國外醫(yī)學(xué)-外科學(xué)分冊,2003,1(3)：21-23.

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