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      對(duì)雞卵黃免疫球蛋白兩種提取方法的比較

      2011-06-19 05:25:46皮晉魁張煥容
      四川畜牧獸醫(yī) 2011年10期
      關(guān)鍵詞:沉淀法硫酸銨血凝

      皮晉魁,張煥容

      (西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川 成都 610041)

      本試驗(yàn)采用水稀釋法初提IgY,然后分別用硫酸銨沉淀法和冰乙醇分級(jí)沉淀法進(jìn)一步提取IgY,檢測(cè)IgY提取量、純度以及活性效價(jià),為選擇較好的雞卵黃免疫球蛋白(IgY)提取方法提供依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 新鮮雞蛋 購(gòu)自成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院實(shí)訓(xùn)中心。

      1.1.2 主要設(shè)備和試劑 高速冷凍離心機(jī)centrifuge 5804、移液器(Eppendorf公司,德國(guó));電子天平(METTER TOLEDO公司,瑞士);凝膠成像系統(tǒng)VerSa Doc2000、蛋白電泳儀、核酸蛋白檢測(cè)儀(Bio-Rad公司,美國(guó))。

      0.1mol/L PBS(pH 7.4),0.028mol/L NaCl溶液,95%冰乙醇(-20℃預(yù)冷),考馬斯亮藍(lán)染液,SDSPAGE脫色液,30%丙烯酰胺,10%SDS,10%過(guò)硫酸銨,TEMED;0.1mol/L Tris-HCl(pH 8.8),0.1mol/L Tris-HCl(pH 6.8);1000μg/mL結(jié)晶牛血清白蛋白,禽流感病毒H9亞型和新城疫病毒雞胚尿囊液。

      1.2 提取方法及步驟

      1.2.1 卵黃液中水溶性成分(WSF)的分離 新鮮雞蛋用卵黃分離器去除蛋白,之后將卵黃于濾紙上滾動(dòng),吸干,刺破卵黃膜,收集卵黃液。每枚雞蛋抽取10mL卵黃液,分別置于離心管中,以8倍量去離子水稀釋,攪拌10min,使水溶性IgY充分溶出。用0.1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值為5.2,4℃靜置過(guò)夜,然后10000 r/min,4℃離心25min,收集上清液,即得到澄清WSF。

      1.2.2 冰乙醇分級(jí)沉淀法純化IgY 取一半制備好的WSF,向其中加入95%冰乙醇,使冰乙醇終濃度達(dá)到60%(V/V),離心(10000 r/min,4℃,25min),沉淀用0.028mol/L NaCl溶解,過(guò)濾,去除脂蛋白沉淀,濾液再用終濃度為30%的95%冰乙醇沉淀后離心,離心后的沉淀即為IgY,于沉淀中加入10mL 0.1mol/L pH 7.4的 PBS。

      1.2.3 硫酸銨沉淀法純化IgY 取另一半WSF與等體積的0.lmol/L pH 7.4的 PBS混合,攪拌均勻,4℃下逐滴緩慢加入pH 7.0的飽和硫酸銨,至飽和度40%。4℃靜置過(guò)夜,然后于4℃下11000 r/min離心25min,棄上清,沉淀用與WFS等體積的0.1mol/L pH 7.4的PBS溶解,混合均勻后再逐滴加入飽和硫酸銨至飽和度35%。4℃靜置過(guò)夜,再11 000 r/min離心25min,棄上清,于沉淀中加入10mL 0.1mol/L pH 7.4的PBS。

      1.2.4 SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳) 將冰乙醇法和硫酸銨沉淀法提取的樣品各5份和卵黃液樣品1份各30μL分別置1.5mL離心管中,加入上樣緩沖液30μL,置沸水浴5min,待用。灌制8%分離膠,在分離膠頂部加入水飽和異丁醇,讓凝膠聚合半小時(shí)。灌制5%濃縮膠,并將梳子插入濃縮膠液體中,讓凝膠聚合30min。小心拔出梳子,加入電極緩沖液,在加樣孔中依次加入樣品以及蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。接通電源,電壓90 V下電泳,待藍(lán)色指示劑進(jìn)入分離膠后改變電壓為120 V繼續(xù)電泳,在藍(lán)色指示劑到達(dá)凝膠底部后關(guān)閉電源。凝膠沖洗后放入表面皿中,加入考馬斯亮藍(lán)染液浸染(覆蓋凝膠),置水平搖床上輕微搖動(dòng)染色1 h。傾去染色液,以脫色液覆蓋凝膠,置水平搖床輕微搖動(dòng)脫色過(guò)夜,然后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照。

      1.2.5 IgY血凝抑制效價(jià)測(cè)定 參照文獻(xiàn)檢測(cè)冰乙醇法、硫酸銨沉淀法所提取的樣品和卵黃液樣品中的IgY抗新城疫病毒和禽流感病毒H9亞型的血凝抑制效價(jià)。

      1.2.6 用考馬斯亮藍(lán)G250測(cè)定IgY蛋白含量 分別取12只試管編號(hào),其中BSA標(biāo)準(zhǔn)品為1~6號(hào),硫酸銨沉淀法提取樣品為水1~水3號(hào),冰乙醇法提取樣品為醇1~醇3號(hào)。按表1要求加入試劑,振蕩混勻后于室溫下放置5~10min,用核酸蛋白檢測(cè)儀在595nm處檢測(cè)樣品吸光度值,以不含BSA的吸光度值為空白對(duì)照。以標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值為縱坐標(biāo),相應(yīng)蛋白含量值為橫坐標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的蛋白含量,進(jìn)而計(jì)算出樣品中的蛋白質(zhì)含量。

      表1 蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的稀釋

      2 結(jié)果

      2.1 SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果 由圖1可知,SDS-PAGE凝膠條帶顯示的提純蛋白主要集中在60~70KD之間。IgY蛋白重鏈為67KD,與卵黃總蛋白條帶相比,兩種方法都有效地純化出了卵黃抗體IgY,但水稀釋-硫酸銨沉淀法提純的IgY要遠(yuǎn)多于冰乙醇分級(jí)沉淀法的提純量。

      圖1 兩種方法提取的IgY作SDS-PAGE檢測(cè)

      2.2 IgY血凝抑制效價(jià)檢測(cè)結(jié)果 各樣品IgY抗新城疫病毒和禽流感病毒H9亞型的血凝抑制效價(jià)見表2和表3。水稀釋-硫酸銨沉淀法提純的各IgY樣品抗新城疫病毒和禽流感病毒H9亞型的平均血凝抑制效價(jià)分別為6.8和9.4,均高于冰乙醇法提取的IgY效價(jià)4.4和5.8,而卵黃液抗體抗新城疫病毒和禽流感病毒H9亞型的平均血凝抑制效價(jià)分別為7.2和8。

      表2 各樣品抗新城疫病毒的血凝抑制效價(jià)

      表3 各樣品抗禽流感病毒H9亞型的血凝抑制效價(jià)

      2.3 IgY蛋白含量檢測(cè)結(jié)果 根據(jù)表4中蛋白標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值建立圖2所示的蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,該標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.9717,回歸方程為y=0.0012x+0.8769。將兩種純化方法提取的樣品吸光度值(OD值)帶入回歸方程,計(jì)算得出各樣品的蛋白含量,見表6。兩種方法純化后的卵黃抗體IgY濃度見表7。飽和硫酸銨沉淀法提取IgY的產(chǎn)率為829.67μg/mL,冰乙醇分級(jí)沉淀法提取IgY的產(chǎn)率為409.75μg/mL。

      表4 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值

      圖2 蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

      表5 兩種純化方法提取樣品的吸光度值

      表6 兩種純化方法提取樣品的蛋白含量 μg

      表7 每1mL卵黃原液純化后的IgY濃度 μg/mL

      3 討論

      用硫酸銨沉淀法提取的IgY含量高于冰乙醇分級(jí)沉淀法,這個(gè)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。SDSPAGE電泳結(jié)果顯示,各樣品最主要的條帶基本分布在60~70KD之間,與IgY重鏈67KD大小相吻合;另外,25~30KD間兩種方法均有一條比較淡的條帶,屬于IgY輕鏈。由SDS-PAGE電泳結(jié)果可以看出,兩種方法所提取的IgY純度均比較高。根據(jù)文獻(xiàn),IgY各種提取方法均對(duì)其活性有一定影響。本試驗(yàn)中水稀釋-硫酸銨沉淀法提取的IgY抗新城疫病毒和禽流感病毒H9亞型的血凝抑制效價(jià)與卵黃液血凝抑制效價(jià)相當(dāng),而水稀釋-硫酸銨沉淀法提取的IgY效價(jià)高于冰乙醇提取法,與文獻(xiàn)中報(bào)道的水稀釋-硫酸鹽提取法對(duì)蛋白活性影響較小相吻合。綜上,水稀釋-硫酸銨沉淀法較冰乙醇法提取的IgY的產(chǎn)率和活性均更高,是相對(duì)較好的提取IgY的方法。

      [1]江千舟,樊明文,邊 專.雞卵黃免疫球蛋白(IgY)分離純化方法研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊(cè),2000,23(4):168-171.

      [2]Carlander D,Stalberg J,Larsson A.Chicken antibodies:a clinical chemistry perspective [J].Ups JMed Sci.,1999,104(3):179-189.

      [3]Hatta H,Tsuda K,Akachi S,et al.Productivity and some properties of egg yolk antibody(IgY)against human rotavirus compared with rabbit IgG[J].Biosci Biotechnol Biochem.,1993,57(3):450-454.

      [4]Hoffman W L,Ruggles A O,Tabarya D.Chicken anti-protein A prevents Staphylococcus aureus protein A from binding to human and rabbit IgG in immunoassays and eliminates most false positive results[J].J Immunol Methods,1996,198(1):67-77.

      [5]任國(guó)平,徐啟紅.冰乙醇分級(jí)離心法分離純化雞卵黃免疫球蛋白的研究[J].食品科技,2008,(2):15-19.

      [6]宋宏新,高棟.制備雞卵黃免疫球蛋白的去脂方法研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2001,23(6):29-32.

      [7]薛海燕,宋宏新.雞卵黃免疫球蛋白分離純化方法的研究進(jìn)展[J].陜西科技大學(xué)學(xué)報(bào),2003,21(4):86-89.

      [8]宋宏新,劉玄,梁艷.雞卵黃免疫球蛋白的分離制備研究[J].食品科學(xué),2005,26(4):51-54.

      [9]楊帆,劉先菊,林樹柱,等.改良的硫酸銨沉淀法純化大雁的卵黃抗體[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2007,(11):626-628.

      [10]LaemmLi U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature,1970,227:680-685.

      [11]馬興樹.禽傳染病實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006.

      [12]李肖梁,錢婭,祝春蕾,等.蛋黃中抗嗜水氣單胞菌IgY的提取和純化[J].中國(guó)家禽,2006,(15):10-15.

      [13]白小麗,梁侯明.四種雞卵黃抗體免疫球蛋白純化方法的研究[J].廣州食品工業(yè)科技,2003,19(4):22-26.

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