基于葡萄糖氧化酶-鉑納米粒子修飾的玻碳電極用于葡萄糖的檢測

王明星，何婧琳，陳傳奇，曹 忠

(長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，電力與交通材料保護(hù)湖南省重點實驗室，湖南長沙410004)

0 引言

葡萄糖是動植物體內(nèi)重要的碳水化合物，是活細(xì)胞的能量來源和新陳代謝中間產(chǎn)物，但血糖過高會引起糖尿病，繼而誘發(fā)心血管、高血壓、神經(jīng)紊亂等多種病癥，危害人的生命健康；而且糖尿病在我國的發(fā)病率較高，因此人體血液中葡萄糖的快速測定對糖尿病的臨床診斷和治療及相關(guān)生命科學(xué)領(lǐng)域都具有非常重要的意義[1]。目前，測定葡萄糖的方法主要有分光光度法[2]、高效液相色譜法[3]、毛細(xì)管電泳法[4]等，然而這些方法操作復(fù)雜、分析速度慢、成本較高，且在檢測范圍和靈敏度方面很難達(dá)到低濃度檢出限。因此，發(fā)展能夠快速、簡便、靈敏地檢測低濃度葡萄糖的方法，具有十分重要的現(xiàn)實意義。

近年來，葡萄糖傳感器由于靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡單等優(yōu)點已成為生化分析和臨床檢驗等方面的一個重要研究方向[5]。1967年Updike和Hicks首次研制出以鉑電極為基體的葡萄糖氧化酶(GOD)電極[6]，用于定量檢測血清中的葡萄糖含量，第一代葡萄糖傳感器由此誕生。該類型傳感器在施加電位的條件下，通過檢測溶液中氧氣的減少量來檢測葡萄糖的含量，但是該傳感器的性能容易受溶解氧的變化、pH值、以及溫度等條件的影響。由此，Cass等[7]在GOD電極中引入化學(xué)介體，以水不溶性二茂鐵單羧酸為介體，將GOD固定在石墨電極上制備出第二代GOD電極，提高了檢測靈敏度。第三代葡萄糖電極則是在無媒介體存在下，利用酶與電極直接的電子傳遞作用而制備的[8]。此外，在葡萄糖傳感器制備中使用納米材料，可增加酶的吸附量和穩(wěn)定性、提高酶的催化活性、增大傳感器的電流響應(yīng)靈敏度，借助貴金屬納米粒子修飾的葡萄糖酶電極已有報道[9～10]。其中由于鉑納米粒子比表面積大、表面反應(yīng)活性高[11～13]，能對很多的電化學(xué)檢測起到信號增強(qiáng)和放大的作用[14～16]，具有優(yōu)于其他納米材料的催化性能而得到了廣泛關(guān)注。目前利用鉑納米粒子修飾電極制備葡萄糖傳感器，漸有報道[17～18]，但由于其電極的制備過程較復(fù)雜、成本較高、重現(xiàn)性欠佳，限制了其實際應(yīng)用。

該文提出了一種基于葡萄糖氧化酶-鉑納米粒子修飾的、可快速靈敏檢測葡萄糖的電化學(xué)生物傳感器，即在室溫條件下，將制備的分散性良好的鉑納米粒子與聚乙烯醇縮丁醛(PVB)的乙醇溶液混合，用溶膠-凝膠法在工作電極上固定GOD。結(jié)果表明，所構(gòu)建的葡萄糖生物傳感器制備過程簡單、成本低、重現(xiàn)性好，穩(wěn)定性也得到了較大的提高，呈現(xiàn)出良好的電化學(xué)性能，且加入鉑納米粒子能顯著增強(qiáng)酶的催化作用，提高傳感器的檢出限和靈敏度。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI-760B型電化學(xué)工作站 (上海辰華儀器有限公司)，TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，JEM-1230(HC)型透射電子顯微鏡 (日本電子株式會社)，KQ-100B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，85-2型恒溫磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)。

氯鉑酸(湖南試劑廠)，聚乙烯吡咯烷酮(K-30，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑研究院)，聚乙烯醇縮丁醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），亞鐵氰化鉀(≥99.5%,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)，磷酸氫二鈉(北京紅星化工廠)，磷酸二氫鈉 (≥99.0%，上海新華化工廠)，氯化鉀 (湖南匯虹試劑有限公司)，檸檬酸三鈉 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，D-葡萄糖(臺山臺城化工廠)，無水乙醇(安徽安特生物化學(xué)有限公司)，葡萄糖氧化酶(湖南師范大學(xué)試劑廠)，以上試劑均為AR或BR級，實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 鉑納米粒子的制備

先配制 H2PtCl6水溶液（5.87×10-3mol/L），取5.0mL于錐形瓶中，加入52.0 mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，用蒸餾水稀釋至50mL，混合均勻；再稱取 16.7 mg NaBH4，用 30mL 蒸餾水溶解，保持硼氫化鈉與氯鉑酸的摩爾比為15∶1，在攪拌下緩慢滴加到錐形瓶中，分別在加熱90℃和室溫20℃條件下反應(yīng) 2.5、3.0、3.5、4.0 h 后制備鉑納米粒子，制得的鉑納米溶膠放入冰箱于4℃中保存。

1.3 葡萄糖傳感器的制備

將玻碳電極(GCE)先用金相砂紙拋光，再用粒徑 1.0、0.3、0.05 μm Al2O3逐級拋光后得到明亮的鏡面，用去離子水洗去表面污物，再分別浸在丙酮、硝酸(1∶3)、去離子水中超聲振蕩清洗1～3 min，置于室溫下晾干，備用。

取10 μL 12 mg/L的葡萄糖氧化酶 (GOD)溶液與5mL的鉑納米溶膠混勻，加入到5mL 2%聚乙烯醇縮丁醛(PVB)的無水乙醇凝膠溶液中混合均勻，取10 μL上述混合液滴加到GCE上靜置12 h，然后真空干燥，獲得GOD-Pt納米粒子修飾的玻碳電極(GOD-Pt/GCE)；作為比較，不添加鉑納米溶膠，按同樣方法制備了GOD修飾玻碳電極（GOD/GCE），所有電極均保存在4℃冰箱中備用。

1.4 檢測方法

利用循環(huán)伏安法可進(jìn)行電極制備過程的表征和對葡萄糖生物傳感器的檢測。采用三電極體系，修飾電極為工作電極，甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對電極，整個試驗在50 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液 (PBS，pH=6.8，含KCl 0.1 mol/L)中進(jìn)行，電位區(qū)間為-1.2～1.2 V，掃描速率為100 mV/s。根據(jù)葡萄糖濃度與氧化還原峰電流值的線性響應(yīng)關(guān)系進(jìn)行定量測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 鉑納米粒子的制備條件優(yōu)化

通過紫外-可見吸收光譜考察了不同反應(yīng)時間（2.5、3.0、3.5、4.0 h）對鉑納米粒子制備反應(yīng)體系的影響。H2PtCl6水溶液在200 nm和268 nm左右有特征吸收峰，當(dāng)NaBH4加入后，PtCl62-逐漸還原為Pt0，隨著反應(yīng)時間的增加，268 nm處的吸收峰強(qiáng)度逐漸減弱；當(dāng)攪拌反應(yīng)4 h后，268 nm處的特征吸收峰已完全消失，說明形成了穩(wěn)定的鉑納米粒子溶膠，故鉑納米粒子制備的最佳反應(yīng)時間為4 h。

實驗還考察了不同溫度對鉑納米粒子制備反應(yīng)體系的影響，圖1a和1b分別為加熱90℃和室溫20℃的反應(yīng)條件下所制備鉑納米粒子的TEM圖。由圖1可見，加熱90℃條件下所制備的鉑納米粒子團(tuán)聚的比較嚴(yán)重，分散性欠佳（見圖1a）；而在室溫20℃條件下得到的鉑納米顆粒形貌呈球形，顆粒分散性較好，且粒徑在5～7 nm（見圖1b），說明采用還原法在室溫條件下就能快速合成穩(wěn)定的球形鉑納米顆粒，加熱易促使鉑納米顆粒團(tuán)聚，其原因是：首先，還原劑NaBH4與水極易反應(yīng)，加熱時NaBH4與水反應(yīng)速率加快，致使NaBH4不能完全還原H2PtCl6；其次是保護(hù)劑PVP的問題，在加熱攪拌時，溶解后的PVP出現(xiàn)大量泡沫，溶液出現(xiàn)了一定程度的渾濁，致使PVP不能很好地起到防止鉑納米溶膠團(tuán)聚的目的；而在室溫條件下得到的鉑納米顆粒分散均勻，顆粒粒度分布集中。因此實驗選用室溫20℃條件下制備鉑納米粒子。

圖1 在加熱90℃(a)和室溫20℃(b)的反應(yīng)條件下所制備鉑納米粒子的TEM圖Fig.1 TEM of Pt nanoparticles synthesized under different reaction temperature of 90 ℃(a)and 20 ℃(b)

2.2 電極修飾過程循環(huán)伏安特性

實驗考察了電極GOD-Pt/GCE在不同濃度介 質(zhì) 溶 液 如 含 0、10、20、30、40、 50 mmol/L溶液（PBS為緩沖底液）中的循環(huán)伏安特性，發(fā)現(xiàn)電極在溶液中的電流響應(yīng)值最大，故考察電極修飾過程時選用20溶液為介質(zhì)。

針對電極修飾過程，實驗考查了裸玻碳電極(GCE)、GOD 修飾玻碳電 極 (GOD/GCE)、GOD-Pt納米粒子修飾玻碳電極 (GOD-Pt/GCE)在20

圖2 裸 GCE(a)、GOD/GCE(b)和 GOD-Pt/GCE(c)在 20 mmol/L Fe(CN)6-3/-4溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms of the bare GCE(a),GOD/GCE(b),and GOD-Pt/GCE(c)were obtained in 20 mmol/L Fe(CN)6-3/-4solution

2.3 鉑溶膠浸泡時間的影響

實驗考察了酶電極GOD-Pt/GCE在制備過程中受鉑溶膠浸泡時間的影響，其在20 mmol/L Fe(CN)6-3/-4溶液中的循環(huán)伏安特性如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)鉑溶膠浸泡的時間分別為1、4、8、12 h時，電極的響應(yīng)電流會隨浸泡時間的增加而增大；而當(dāng)浸泡時間太長，超過12 h時，電極的響應(yīng)電流反而減小，其中在12 h時達(dá)到最大。這是因為隨著浸泡時間的增加，鉑納米粒子在GCE上的數(shù)量逐漸增加，比表面積逐漸增大，所以電極響應(yīng)電流不斷增大；當(dāng)浸泡到一定時間（如12 h），鉑納米粒子在GCE上達(dá)到飽和，隨著時間的延長，鉑顆粒發(fā)生堆集，導(dǎo)致比表面積減小，使電極材料的活性受到損害，從而使響應(yīng)電流反而減小。

圖3 GOD-Pt/GCE受鉑溶膠浸泡時間的影響時間：(a)1 h,(b)4 h,(c)8 h,(d)12 h,(e)16 h,(f)20 h;介質(zhì)：20 mmol/L Fe(CN)6-3/-4溶液Fig.3 Effects of the soaking time of Pt sol solution on the GOD-Pt/GCE biosensor Time:(a)1 h,(b)4 h,(c)8 h,(d)12 h,(e)16 h,(f)20 h;Media:20 mmol/L Fe(CN)6-3/-4solution

2.4 GOD用量的選擇

實驗考查了酶電極GOD-Pt/GCE在制備過程中受不同濃度GOD用量的影響。當(dāng)GOD濃度分別為 4、8、12、16 mg/L 時，所制備的電化學(xué)傳感器對4.00×10-3mol/L葡萄糖的響應(yīng)電流情況如圖4所示。由圖4可以看出，電極的響應(yīng)電流隨著GOD濃度的增加而增大，在12 mg/L時達(dá)到飽和不再增大，由此可以確定GOD的最佳濃度為12 mg/L。

圖4 GOD-Pt/GCE受不同濃度GOD用量的影響Fig.4 Effect of the GOD concentration on the GOD-Pt/GCE biosensor

2.5 葡萄糖傳感器的響應(yīng)性能

2.5.1 傳感器的線性范圍及檢測限

實驗考查了酶電極GOD-Pt/GCE對不同濃度葡萄糖的響應(yīng)情況。隨著葡萄糖濃度的增加，電極響應(yīng)的峰電流值也逐漸增加，圖5為酶電極GOD-Pt/GCE響應(yīng)葡萄糖的校正曲線。從圖中可知， 傳感器在 1.60×10-5～2.40×10-3mol/L 范圍內(nèi)的響應(yīng)電流與葡萄糖濃度成線性關(guān)系，其校正曲線方程可擬合為：y=-0.041 93x-69.754 6，(x 為葡萄糖濃度；y 為峰電流響應(yīng)值，r=0.999 6，n=9)。根據(jù)作圖法可求出實際可檢測的最低濃度 （如圖5的內(nèi)插圖 所示），即檢測下限為 8.00×10-6mol/L。

2.5.2 傳感器的重現(xiàn)性、選擇性、穩(wěn)定性和使用壽命

將按照上述方法制備好的GOD-Pt/GCE在4.50×10-4mol/L 和 10.85×10-4mol/L 的葡萄糖溶液中來回進(jìn)行6次測試，結(jié)果見表1，表明該傳感器在兩種溶液響應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.85%和0.50%。說明傳感器的重現(xiàn)性較好。

選擇性是傳感器能否應(yīng)用的一個重要考核指標(biāo)。實驗考察了該電極在4.50×10-4mol/L葡萄糖溶液中分別加入10倍濃度的抗壞血酸、尿酸、果糖后的電流響應(yīng)情況，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)明顯的電流增強(qiáng)響應(yīng)信號，說明抗壞血酸、尿酸、果糖等對葡萄糖傳感器無明顯的干擾。

圖5 酶電極GOD-Pt/GCE響應(yīng)葡萄糖的校正曲線Fig.5 Calibration curve of the GOD-Pt/GCE responding to glucose

傳感器的穩(wěn)定性是分析檢測應(yīng)用的一個重要性能指標(biāo)。實驗考察了該電極在4.50×10-4mol/L葡萄糖溶液中連續(xù)檢測12 d，每間隔1 d記錄一次數(shù)據(jù)，其電流響應(yīng)過程如圖6所示，該電極的響應(yīng)平均值為-83.99±3.24 μA(n=6)，其電流響應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.86%，說明該傳感器具有較好的穩(wěn)定性。且電極經(jīng)過12 d使用后，響應(yīng)電流下降至最初值的90%，說明傳感器至少可以使用12 d。

表1 GOD-Pt/GCE檢測葡萄糖的重現(xiàn)性Tab.1 Reproducibility of GOD-Pt/GCE for glucose determination

圖6 傳感器檢測葡萄糖（4.50×10-4mol/L）的穩(wěn)定性曲線Fig.6 Stability curve of the sensor for detection of glucose at concentration of 4.50×10-4mol/L

2.5.3 傳感器的回收率與分析應(yīng)用

將按照上述方法制備好的GOD-Pt/GCE，對實驗室配制的6個葡萄糖樣品溶液的濃度進(jìn)行了加標(biāo)回收測試，結(jié)果表明其回收率在96.82%～101.29%之間（見表 2），說明 GOD-Pt/GCE 能夠較好地應(yīng)用于葡萄糖的快速檢測。

表2 傳感器的回收率Tab.2 Recovery of the glucose biosensor

同時，將該酶電極GOD-Pt/GCE分別用于湖南明園蜂業(yè)有限公司和北京慈生堂食品有限公司的兩種不同品牌蜂蜜中的葡萄糖含量的測試，數(shù)據(jù)列于表3中，由表3可知酶電極與高效液相色譜（HPLC）方法檢測結(jié)果較一致,說明GOD-Pt/GCE能夠很好地應(yīng)用于蜂蜜產(chǎn)品中葡萄糖含量的檢測。

表3 蜂蜜中葡萄糖含量的測定Tab.3 Determination of glucose in honey products

3 結(jié)論

該文探討了一種基于鉑納米粒子修飾電極用于葡萄糖檢測的電化學(xué)生物傳感器。采用化學(xué)還原法在室溫下制得的鉑納米粒子，與2%PVB的無水乙醇凝膠構(gòu)成的復(fù)合固酶基質(zhì)，取10 μL 12 mg/L的GOD溶液，采用溶膠-凝膠法固定GOD于GCE表面，制備了葡萄糖生物傳感器。實驗發(fā)現(xiàn)鉑納米粒子可以大幅度提高傳感器的催化響應(yīng)電流，加速電子傳遞，從而提高了傳感器的靈敏度和檢測限。該傳感器重現(xiàn)性、選擇性、穩(wěn)定性好、使用壽命較長，回收率在 96.82%～101.29%之間，可應(yīng)用于實際樣品蜂蜜中葡萄糖含量的檢測。

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