顧曉潔，穆軍，張翼，梁羽甜，李文

(大連交通大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116028)＊

0 引言

由微生物引起的感染性疾病是我國最常見的疾病.隨著感染性疾病發(fā)病率的上升和各類抗生素新藥的不斷涌現(xiàn)，臨床治療急需的新型抗感染藥物將成為醫(yī)藥市場上增長新熱點.海洋細(xì)菌中蘊藏著許多具有生物活性的新化合物，是開發(fā)新藥的寶貴資源，在眾多的海洋細(xì)菌活性代謝產(chǎn)物中，抗微生物活性一直受到廣泛的關(guān)注，因而篩選抗菌活性化合物產(chǎn)物已成為藥物研發(fā)的重要方面［1-2］.

從海洋底泥中分離海洋厭氧細(xì)菌具有取材方便、細(xì)菌種類豐富的特點.然而，目前大多數(shù)具有抗菌生物活性的海洋細(xì)菌主要從海洋動物、植物體表或者體內(nèi)分離得到，直接從海洋底泥中進行具有抗菌生物活性的海洋厭氧細(xì)菌分離與鑒定的研究則少有報道［3］.反硝化細(xì)菌多屬革蘭氏陰性細(xì)菌，是指能引起反硝化作用的細(xì)菌.迄今為止，對于反硝化細(xì)菌的研究僅限于土壤［4］、大氣［5］、污水處理［6］、水產(chǎn)養(yǎng)殖［7］和菌株的分離、鑒定與活性篩選［8］五方面.

圖1 化合物1-4的結(jié)構(gòu)式

本文以海洋厭氧反硝化細(xì)菌Pseudomonas stutzeri(No.DN7)的次生代謝產(chǎn)物為研究對象，從其乙酸乙酯部分得到4個活性單體化合物(結(jié)構(gòu)式見圖1)，并對其進行鑒定和抗菌活性測試，為今后更多活性成分的制備分離奠定了基礎(chǔ)，對新抗生素的篩選及新藥的開發(fā)也具有重要的意義.

1 實驗方法

1.1 材料、試劑與儀器

研究所用菌株于2007年10月從中國渤海海域的海洋底泥中分離獲得.經(jīng)大連交通大學(xué)資源與環(huán)境生物技術(shù)研究所穆軍教授鑒定為Pseudomonas stutzeri(No.DN7)，已于2008年10月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為:CGMCC No.2732.活性指示菌:銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)購自中國科學(xué)院微生物研究所.

所用試劑除供高效液相色譜分析用甲醇之外，均為分析純.

SDJ-超凈工作臺(上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠)，SPX-250B型生化培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)，三用紫外分析儀(上海精科實業(yè)有限公司)，Thermo Scientific Multiskan Ascent型酶標(biāo)儀(上海賽默飛世爾科技公司)，P230型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)，C18-HPLC柱(Hypersil 5 μm 填料，4.6 mm ×250 mm，大連依利特分析儀器有限公司)，EI-MS譜用JMSD300型質(zhì)譜儀，Bruker AC2300型核磁共振儀(德國Bruker公司)).

1.2 提取與分離

100 L菌株發(fā)酵液濃縮至5 L，依次用等體積乙酸乙酯、正丁醇萃取.乙酸乙酯萃取部分去除溶劑得到固體約5.6 g.正丁醇萃取部分濃縮去除正丁醇，甲醇溶解后抽濾，棄去不溶物，反復(fù)3次脫去無機鹽，合并濾液濃縮至干得到固體約27.1 g.對乙酸乙酯部分進行ODS硅膠柱層析，依次用30%、50%、70%、90%、100%甲醇洗脫.采用紙片法模型篩選層析各組份的抗菌活性［8］，發(fā)現(xiàn)30%、70%甲醇洗脫部分具有明顯活性(見附表).30%甲醇洗脫部分HPLC色譜分離條件:檢測器 UV，柱溫 25℃，流速 1 mL/min，波長 =254 nm，流動相為甲醇－水=30%，收集時間為20.1 min，得到化合物 1(5 mg);收集時間 25.9 min，得到化合物2(3 mg).70%甲醇洗脫部分HPLC色譜分離條件:檢測器UV，柱溫 25℃，流速1 mL/min，波長=254 nm，流動相為甲醇－水=70%，收集時間為16.6 min，得到化合物3(5 mg);收集時間18.1 min，得到化合物4(4 mg).

附表 DN7樣品各組分抑菌圈直徑 mm

1.3 單體化合物的活性評價

化合物1-4配制成所需濃度的甲醇溶液，按照濃度高低依次加入96孔板，45℃減壓揮干.用無菌生理鹽水將銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別制成0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?精密吸取20 μL的菌懸液加入裝有20 mL液體M-H培養(yǎng)基的三角瓶中稀釋1000倍，在96孔板每孔中加入100 μL稀釋液，35℃培養(yǎng)16～24 h.每個樣品均做3次平行實驗.用酶標(biāo)儀在595 nm和630 nm處測定其吸光度值，測定完畢后，每空加入25 μL 5 mg/mL MTT(四氮唑藍(lán))溶液染色，20 min后在540 nm處再次測定吸光度值.通過公式:抑菌率(%)=(陰性對照OD值－樣品OD值)/陰性對照OD值×100，計算化合物1～4在540 nm處的抑菌率(見圖2～5).

圖2 化合物1的抑菌率

圖3 化合物2的抑菌率

圖4 化合物3的抑菌率

圖5 化合物4的抑菌率

2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:淡黃色針晶.EI-MS(m/z):145(M+)，144(M+-H，100%).1H NMR(500 MHz，MeOD)δ:7.29(2H，m，H-5，6)，7.47(1H，dd，J=5.3 Hz，3.7 Hz，H-7)，7.85(1H，d，J=2.8 Hz，H-2)，8.23(1H，dd，J=5.3 Hz，3.4 Hz，H-4)，8.83(1H，b，NH)，9.97(1H，s，CHO).13C NMR(125 MHz，MeOD)δ:187.4(CHO)，139.6(C-2)，122.4(C-4)，123.6(C-6)，125.0(C-5)，113.1(C-7).以上數(shù)據(jù)與文獻［9］報道一致，故確定化合物1為3-吲哚甲醛.

化合物2:無色針晶.EI-MS(m/z):152(M+)，151(M+-H，100%).1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ:7.72(2H，dd，J=3.3，5.7 Hz，H-2，H-6)，7.52(2H，dd，J=3.3，5.7 Hz，H-3，H-5)，3.9(3H，s，-OCH3).13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ:160.9(C-7)，132.7(C-1)，131.9(C-4)，131.1(C-3)，131.1(C-5).以上數(shù)據(jù)與文獻［10］報道基本一致，故鑒定化合物2為對羥基苯甲酸甲酯.

化合物3:白色固體.EI-MS(m/z):278(M+)，277(M+-H，100%).1H NMR(500 MHz，MeOD)δ:7.74(2 H，m，H-3，6)，7.60(2 H，m，H-4，5)，4.08(4 H，d，J=6.8 Hz，H-1'，1″)，2.04(2 H，J=6.7 Hz，H-2'，2″)，0.99(12H，d，J=6.8 Hz，H-3'，3″，4'，4″).13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ:169.3(C-7，8)，133.6(C-1，2)，132.4(C-4，5)，130.0(C-3，6)，72.9(C-1'，1″)，28.9(C-2'，2″)，19.4(C-3'，3″，4'，4″).以上數(shù)據(jù)與文獻［11］報道一致，故確定化合物3為鄰苯二甲酸二異丁酯.

化合物4:白色固體.EI-MS(m/z):278(M+)，277(M+-H，100%).1H NMR(500 MHz，MeOD)δ:7.73(2 H，m，H-3，6)，7.60(2 H，m，H-4，5)，4.29(4 H，t，J=6.7 Hz，H-1'，1″)，1.72(4 H，J=7.2 Hz，，H-2'，2″)，1.45(4 H，J=7.4 Hz，H-3'，3″)，0.98(6 H，t，J=7.5 Hz，H-4'，4″).13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ:169.3(C-7，8)，133.6(C-1，2)，132.3(C-4，5)，129.9(C-3，6)，66.7(C-1'，1″)，31.7(C-2'，2″)，20.2(C-3'，3″)，14.0(C-4'，4″).以上數(shù)據(jù)與文獻［12］報道一致，故確定化合物4為鄰苯二甲酸二正丁酯.

3 結(jié)論

本文采用抗菌活性追蹤的方法，首次從海洋厭氧反硝化細(xì)菌Pseudomonas stutzeri(No.DN7)次生代謝產(chǎn)物的乙酸乙酯部分分離并鑒定了4個活性單體化合物.同時，應(yīng)用MTT法對化合物1-4進行活性評價，研究結(jié)果表明化合物3、4具有較好的枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的抑菌活性，化合物1、2的抑菌活性一般.該結(jié)論為今后更多活性成分的制備分離奠定了基礎(chǔ)，對新抗生素的篩選及新藥的開發(fā)也具有重要的意義.

［1］KELECOM A.Secondary metabolites from marine microorganisms［J］.Anaisda AcademiaBrasileirade Ciências，2002，74(1):151-170.

［2］BUGNI TS，IRELAND CM.Marine-derived fungi:a chemically and biologically diverse group of microorganisms［J］.Natural Product Report，2004，21(1):143-163.

［3］ZHANG Y，MU J，GU XJ，et al.A marine sulfate-reducing bacterium producing multiple antibiotics:biological and chemical investigation ［J］.Marine Drugs，2009，7(3):341-354.

［4］林麗玉，高霞靈，吳萍茹，等.海洋藥物資源的微生物的分離技術(shù)［J］.中國海洋藥物，1999，3:15-18.

［5］岳進，史奕，黃國宏，等.大氣CO2濃度增高對麥田土壤硝化和反硝化細(xì)菌的影響［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2004，5:67-70.

［6］薛蕾，蒯琳萍.一株新反硝化菌的鑒定及在廢水處理中的應(yīng)用［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2008，31(7):98-100.

［7］李平，張山，鄭永良.反硝化真菌-細(xì)菌優(yōu)化組合及脫氮能力研究［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2006，29(3):9-10.

［8］FU BF，ZHANG Y，MU J，et al.Isolation，identification，and antimicrobial activity of a denitrifying bacterium from marine sediments［C］.The 3rd International Conference on Bioinformatics and Biomedical Engineering，iCBBE，2009.

［9］李文林，毛士龍，易楊華，等.豐頭皮海綿化學(xué)成分研究［J］.中國海洋藥物，2000，3:1-4.

［10］葛潔虹，高程海，王萍，等.南海二叉黑角珊瑚化學(xué)成分研究［J］.中藥材，2010，33(9):1403-1405.

［11］ZHANG W，LOU HX，LI GY，et al.A new triterpenoid from Entodon okamurae broth［J］.Journal of Asian Natural Products Research，2003，5(3):189-195.

［12］李莉婭，鄧志威，李軍，等.中國南海海綿C inachyrella australiensis化學(xué)成分研究［J］.北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2004，36(1):12-17.