謝華健，周小敏，林奇棟

（儋州市第一人民醫(yī)院，海南 儋州 571700）

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱“哮喘”)是一種由多因素引起的以可逆性氣道阻塞、氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥為特征的免疫變態(tài)反應(yīng)性疾病，其中以氣道炎癥為最主要的病理變化，并決定氣道阻塞和氣道高反應(yīng)性的程度[1]。輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子在哮喘慢性氣道炎癥中起主要作用[2]，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+T細(xì)胞對(duì)于維持自身免疫耐受，抑制自身免疫性疾病具有重要作用[3-4]。本文以52例急性哮喘患者和56例慢性哮喘患者為研究對(duì)象，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)哮喘患者外周血中Th1、Th2和CD4+CD25+T細(xì)胞的水平，觀察Th1/Th2細(xì)胞平衡的變化，并選擇60名健康人群作為對(duì)照，探討Th細(xì)胞和CD4+CD25+T細(xì)胞與哮喘發(fā)病的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選自2008年1月至2010年1月在我院門診和住院治療的哮喘患者，診斷及病情嚴(yán)重程度分類均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病分會(huì)哮喘學(xué)組制定的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。所有哮喘患者均仔細(xì)詢問病史及嚴(yán)格體檢，必要時(shí)檢查X線胸片排除肺炎。108例哮喘患者中，急性哮喘患者52例(急性組)，男29例，女23例，年齡18～63歲，平均 (46.2 ±12.6)歲；慢性哮喘患者56例(慢性組)，男32例，女24例，年齡21～66歲，平均(49.5±16.3)歲；60名健康對(duì)照人群(對(duì)照組)均來自同期我院健康體檢中心體檢，男34例，女26例，年齡20～60歲，平均 (39.7 ±14.8)歲。所有對(duì)象均排除腦外傷、腦腫瘤、腦血管疾病、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及其他系統(tǒng)疾病，各組的年齡差異和性別分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑和儀器 鼠抗人單克隆抗體(mAb)CD3-FITC、CD8-PercP、IFN-γ-PE、IL-4-PE、CD4-PercP、CD25-PE及其相應(yīng)同型對(duì)照IgG1-PE、IgG2a-PE和FACS Calibur流式細(xì)胞儀均為美國(guó)Becton Dickinson公司產(chǎn)品。佛波酯(PMA)、離子霉素(Ionomycin)以及布雷菲德菌素A(BFA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2.2 Th1、Th2細(xì)胞測(cè)定 安靜狀態(tài)下無(wú)菌抽取研究對(duì)象空腹靜脈血2 ml，肝素鈉抗凝，取400 μl平均分為刺激管及未刺激管，前者加入PMA(1 mg/L)、Ionomycin(50 mg/L)及 BFA(0.5 g/L)，后者僅加入BFA。混勻后加進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。收集細(xì)胞，分為對(duì)照管和試驗(yàn)管，分別加入mAbCD3-FITC及CD8-PercP各20 μl進(jìn)行胞膜表面標(biāo)記染色，室溫避光孵育15 min，固定洗滌細(xì)胞進(jìn)行破膜及胞內(nèi)因子標(biāo)記，每管中加入100 μl破膜劑及相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)因子mAb IFN-γ-PE、IL-4-PE和相應(yīng)陰性對(duì)照IgG1-PE、IgG2a-PE各20 μl，室溫避光15 min。洗滌并加500 μl PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 CD4+CD25+T細(xì)胞檢測(cè) 安靜狀態(tài)下無(wú)菌抽取研究對(duì)象空腹靜脈血2 ml，肝素鈉抗凝，分別向檢測(cè)管和同型對(duì)照管中加入外周血100 μl，檢測(cè)管加入mAbCD4-PercP及CD25-PE各20 μl，同型對(duì)照管加入同型對(duì)照鼠抗人IgG1/PE及IgG2a/PE標(biāo)記抗體各20 μl，混勻，室溫避光孵育15 min后，每管各加紅細(xì)胞裂解液3 ml，振蕩混勻后置室溫孵育15 min，至液體透亮，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μl磷酸緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞，室溫避光10 min后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 檢測(cè)分析細(xì)胞 用同型對(duì)照確定熒光陰性范圍，設(shè)定相應(yīng)各信道電壓及之間的熒光補(bǔ)償后，依次使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)標(biāo)本，根據(jù)前向散射(FSC)和側(cè)向散射角(SSC)對(duì)淋巴細(xì)胞群進(jìn)行設(shè)門，每次獲取設(shè)門內(nèi)10 000個(gè)細(xì)胞，用CellQuest軟件獲取并分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用單因素的方差分析對(duì)各組外周血中Th1、Th2水平、Th1/Th2比值和CD4+CD25+細(xì)胞的水平進(jìn)行比較，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行組間兩兩比較(LSD法)，上述分析均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以α=0.05為統(tǒng)計(jì)意義水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組外周血中Th1、Th2水平和Th1/Th2比值 由表1可知，各組外周血中Th1、Th2水平和Th1/Th2比值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。組間兩兩比較(表2)顯示：急性組患者外周血中Th1水平顯著低于慢性組患者和健康對(duì)照人群(P＜0.05)，同時(shí)慢性組患者與健康對(duì)照人群的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；急性組患者外周血中Th2水平顯著高于慢性組患者和健康對(duì)照人群(P＜0.05)，同時(shí)慢性組患者與健康對(duì)照人群的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；急性組患者外周血中Th1/Th2比值顯著低于慢性組患者和健康對(duì)照人群(P＜0.05)，同時(shí)慢性組患者與健康對(duì)照人群的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 各組外周血中CD4+CD25+細(xì)胞的水平 由表3可知，各組外周血中CD4+CD25+細(xì)胞的水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。組間兩兩比較(表4)顯示：急性組患者外周血中CD4+CD25+細(xì)胞的水平顯著低于慢性組患者和健康對(duì)照人群(P＜0.05)，同時(shí)慢性組患者與健康對(duì)照人群的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組外周血中Th1、Th2水平和Th1/Th2比值（±s）

表1 各組外周血中Th1、Th2水平和Th1/Th2比值（±s）

組別 例數(shù)Th1(%)Th2(%)Th1/Th2急性組慢性組對(duì)照組FP 52 56 60 10.216 0.000 11.62±4.52 13.36±4.34 15.11±3.40 10.216 0.000 3.88±1.32 3.07±0.84 2.46±0.58 31.617 0.000 4.29±1.50 3.07±1.57 7.97±.67 23.333 0.000

表2 外周血中Th1、Th2水平和Th1/Th2比值組間兩兩比較結(jié)果

表3 各組外周血中CD4+CD25+細(xì)胞的水平（%，±s）

表3 各組外周血中CD4+CD25+細(xì)胞的水平（%，±s）

組別急性組慢性組對(duì)照組FP例數(shù)52 56 60 CD4+CD25+4.29±1.50 6.56±1.57 7.97±1.67 75.909 0.000

表4 外周血中CD4+CD25+細(xì)胞的水平組間兩兩比較結(jié)果（±s）

表4 外周血中CD4+CD25+細(xì)胞的水平組間兩兩比較結(jié)果（±s）

組間比較急性組：慢性組急性組：對(duì)照組慢性組：對(duì)照組CD4+CD25+0.000 0.000 0.000

3 討論

哮喘的病因和發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，在其氣道慢性變應(yīng)性炎癥中，有多種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子參與炎癥過程，T淋巴細(xì)胞及其分泌的各種細(xì)胞因子在其中發(fā)揮了重要作用。隨著研究的進(jìn)展，Th細(xì)胞對(duì)哮喘的作用越來越受到重視，成為可能揭示哮喘發(fā)病機(jī)制的一個(gè)新的途徑[6]。Th細(xì)胞根據(jù)其分泌的細(xì)胞因子不同，主要分為Th1和Th2亞群。Th1細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ等細(xì)胞因子，可活化吞噬細(xì)胞，增強(qiáng)其抗感染能力，介導(dǎo)細(xì)胞免疫，同時(shí)可抑制過度的Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)；Th2主要分泌IL-4，而IL-4可促進(jìn)B細(xì)胞分化，誘導(dǎo)B細(xì)胞合成IgE，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。因此，Th2淋巴細(xì)胞在哮喘發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。過敏原對(duì)哮喘患者Th細(xì)胞增殖有選擇性，促進(jìn)Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)，從而使Th1/Th2平衡向Th2轉(zhuǎn)化[7]。當(dāng)Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)時(shí)，IL-4分泌增加，易發(fā)生高IgE血癥，結(jié)果導(dǎo)致哮喘的發(fā)作。本研究結(jié)果顯示：與健康對(duì)照人群組比較，急性哮喘患者外周血中的Th1細(xì)胞明顯降低，而Th2細(xì)胞數(shù)明顯升高，且Th1/Th2比值明顯下降，說明哮喘患者Th亞群之間的平衡發(fā)生了改變，引起Th1細(xì)胞相對(duì)減少而Th2細(xì)胞相對(duì)增加，Th細(xì)胞亞群之間的相互抑制交叉調(diào)節(jié)的功能被削弱，由此可以推測(cè)Th細(xì)胞亞群之間的平衡破壞是哮喘發(fā)病中的重要因素。

2004 年Wickelgren從人的血液中分離到了CD4+CD25+T細(xì)胞，并證實(shí)其對(duì)其他T細(xì)胞的增殖具有抑制作用[8]。近年研究表明，CD4+CD25+T細(xì)胞在維持機(jī)體自身穩(wěn)定性及免疫耐受方面具有重要作用。在體外用抗原刺激后，人類CD4+CD25+T細(xì)胞可以抑制CD4+CD25+T細(xì)胞增殖和Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生[9]。CD4+CD25+T細(xì)胞免疫功能可能是抑制Th2細(xì)胞對(duì)環(huán)境抗原的不適當(dāng)應(yīng)答，所以哮喘等過敏性疾病的發(fā)生機(jī)制可能就是此種調(diào)節(jié)功能的缺陷或者不足。本研究結(jié)果顯示：急性組患者外周血中CD4+CD25+細(xì)胞的水平顯著低于慢性組患者和健康對(duì)照人群。說明CD4+CD25+細(xì)胞數(shù)目的明顯減少，導(dǎo)致抑制Th2細(xì)胞的能力下降，Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加，使哮喘發(fā)病。但是也有研究提示哮喘患者的CD4+CD25+T細(xì)胞在數(shù)量上無(wú)明顯減少，但在功能上存在缺陷[10]。

綜上所述，哮喘患者中Th細(xì)胞和CD4+CD25+T細(xì)胞出現(xiàn)明顯的數(shù)目變化，使某些細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5)的分泌增加，從而介導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫，導(dǎo)致哮喘的發(fā)生。因此Th1和Th2細(xì)胞的平衡破壞、CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)目和功能的下降在哮喘的疾病活動(dòng)中起到重要的作用，是導(dǎo)致哮喘患者細(xì)胞免疫失調(diào)的重要原因。

[1] 白 敏,刁曉源,張湘燕,等.支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2009,15(15):2294-2297.

[2] Mochizuki H,Shigeta M,Morikawa A.Develeprnent of bronchial hyperresponsiveness during childhood[J].J Asthma,2001,38(1):11-21.

[3] Ng WF,Duggan PJ,Ponchel F,et al.Human CD4(+)CD25(+)cells:a naturally occuring population of regulatory T cells[J].Blood,2001,98(9):2736-2744.

[4] 陳萬(wàn)軍,張 恒.CD4+CD25+T免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞在疾病發(fā)生和臨床應(yīng)用中的意義[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2005,85(41):2948-2951.

[5] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病分會(huì)哮喘組.支氣管哮喘防治指南[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2003,26(2):133.

[6] 夏 雯,葛傳生,潘曉勤,等.哮喘發(fā)作期患兒Th1/Th2亞群平衡變化的觀察[J].江蘇醫(yī)藥雜志,2002,28(9):681-682.

[7] Moveragre R,Elfinan L,Stalenheim G,et al.Study of the Th1/Th2balance,including IL-10 production,in cultures of peripheral blood mononuclear cells from birch-pollen-allergic patients[J].Allergy,2000,55(2):171-175.

[8] Wickelgren I.lmmunology:Policing the immune system[J].Science,2004,306(5696):596-599.

[9] Bellinghausen I,Klostermann B,Konp J,et al.Human CD4+CD25+T cells derived from the majority of atopic donors are able to suppress Th1and Th2cytokine production[J].J Allergy Clin Immunol,2003,111(4):862-868.

[10] Lee JH,Yu HH,Wang LC,et al.The levels of CD4+CD25+regulatory T cells in paediatric patients with allergic rhinitis and bronchial asthma[J].J Clin Exp Immunol,2007,148(1):53-63.