廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻植株化學(xué)成分與結(jié)構(gòu)動態(tài)變化

黃 薇，姚清華，陳麗華，宋永康，黃敏敏，李玥仁1福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實驗室;福建省精密儀器農(nóng)業(yè)測試重點實驗室，福建福州 350003

真菌病害是影響農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。近年來，隨著分子植物病理學(xué)和植物基因工程的迅速發(fā)展，利用DNA重組技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將外源抗真菌基因?qū)胨?，培育出抗病水稻新品種，成為解決這一問題的有效途徑(張志忠等，2005;宋冬明等，2010)。在眾多外源抗真菌基因中，具有非特異性的廣譜抗真菌蛋白基因因其具有抗性譜寬、可在多種植物中表達(dá)等優(yōu)勢，而倍受研究者的重視。

廣譜抗真菌蛋白基因在植物組織中的組成型高水平表達(dá)，使得轉(zhuǎn)基因水稻獲得了較高的抗病水平和較寬的抗性譜，但同時也可能造成潛在的生態(tài)風(fēng)險。此外，真菌在植株木質(zhì)素的降解中起著主要的作用，組成型高水平表達(dá)的廣譜抗真菌蛋白有可能抑制真菌對水稻秸稈木質(zhì)素的降解(郁紅艷等，2003)。根據(jù)轉(zhuǎn)基因食品安全評估中的實質(zhì)等同原則(劉曉云和何小維，2005)，本文在前期研究的基礎(chǔ)上，對廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8的整個生長發(fā)育過程中化學(xué)成分的變化進(jìn)行分析，同時利用電子顯微鏡觀察水稻品種的組織顯微結(jié)構(gòu)，以期為進(jìn)一步研究廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻秸稈的降解效率以及環(huán)境安全性評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻品種為廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8及其非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌呓z軟粘。轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8由中山大學(xué)和廣東海洋大學(xué)聯(lián)合選育，是利用基因槍法將2～3個廣譜抗真菌蛋白基因以及標(biāo)記基因hpt導(dǎo)入秈稻品種“七絲軟粘”中，經(jīng)過選育獲得的對稻瘟病Magnaporthe grisea(Hebert)Barr和紋枯病菌Rhizoctonia solani Kühn抗性顯著提高的轉(zhuǎn)基因水稻(馮道榮等，1999)。其中，轉(zhuǎn)品1為三價抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻，轉(zhuǎn)入水稻堿性幾丁質(zhì)酶基因(RC24、RCH10)和水稻酸性幾丁質(zhì)酶基因(RAC22);轉(zhuǎn)品8為雙價抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻，轉(zhuǎn)入目的基因為水稻堿性幾丁質(zhì)酶基因(RC24)和苜蓿葡聚糖酶基因(β-1，3-Glu);啟動子為在水稻中高效表達(dá)的Act1。

1.2 方法

1.2.1 供試水稻的栽培方法 于2008年3月17日在福建省福州市閩侯縣良種場種植供試水稻。供試地貌為閩江兩岸丘陵河谷區(qū)，屬南亞熱帶季風(fēng)氣候。選擇水肥條件一致的隔離試驗水田，試驗水田為梯田形式，面積約為500 m2，分為9個試驗小區(qū)。水田土壤為黃紅壤，總碳含量 16.44 g·kg－1，總氮 1.15 g·kg－1，有效磷 33.31 mg·kg－1，速效鉀68.97mg·kg－1，pH 5.56。田間水肥、栽培技術(shù)管理按當(dāng)?shù)卦耘嗨綄嵤?，每個品種種植3個重復(fù)小區(qū)。水稻測試樣品均以多點隨機(jī)的方法分別于分蘗期、孕穗期、抽穗期、灌漿期、成熟期進(jìn)行采樣。將采回的樣品葉片、葉鞘和莖分開，在105℃下殺青15 min，然后在80℃烘24 h，粉碎后過60目篩，裝入樣品袋存放于干燥器內(nèi)，以備分析待用。

1.2.2 化學(xué)成分測定 秸稈化學(xué)成分含量以干物質(zhì)為比較基礎(chǔ)，依據(jù)van Soest et al.(1991)的方法，采用FOSS纖維浸提器測定秸稈各植物學(xué)部位(葉片、葉鞘、莖)半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的含量。依據(jù)GB/T 6432-1994，采用FOSS全自動凱氏定氮儀測定秸稈葉片、葉鞘、莖的粗蛋白質(zhì)含量。每個樣品設(shè)3個重復(fù)。

1.2.3 組織顯微結(jié)構(gòu)觀察 取成熟期水稻，經(jīng)液氮干燥后，將葉片上表皮和莖稈橫斷面固定在樣品銅臺上，真空離子濺射儀噴金包埋，于日本電子JSM-6380LU掃描電鏡下進(jìn)行觀察、拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用 Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的基本處理，對不同生育期各水稻品種的化學(xué)組分采用SPSS軟件包中的方差分析過程(ANOVA)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻纖維素含量分析

廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8與相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因水稻七絲軟粘在不同生育期葉片、葉鞘和莖的纖維素含量動態(tài)變化趨勢見圖1。從圖中可知，七絲軟粘葉片、葉鞘和莖的纖維素含量在不同生育期內(nèi)均呈現(xiàn)明顯的變化，且各部位的變化趨勢大致相似，即從分蘗期至孕穗期逐漸下降，至抽穗期逐漸增加，至灌漿期逐漸下降，種子灌漿后纖維化程度增加。轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8的變化趨勢與七絲軟粘一致，且含量差異均未達(dá)到顯著水平(P＞0.05)。

2.2 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻半纖維素含量分析

圖2顯示為廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8以及相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因水稻七絲軟粘在不同生育期葉片、葉鞘和莖半纖維素含量的變化趨勢。從圖中可以看出，供試水稻品種的葉片、葉鞘和莖的半纖維素含量變化趨勢基本一致;且除個別情況外，不同生育期品種間各個部位半纖維素含量的差異不顯著(P＞0.05)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，供試品種半纖維素的動態(tài)變化與纖維素成負(fù)相關(guān)，當(dāng)纖維素含量增加時，半纖維素含量下降。由此可見，水稻植株生理上具有一定程度的自主調(diào)節(jié)能力，纖維素與半纖維素的協(xié)同作用，能夠維持對植物體的機(jī)械支撐。此現(xiàn)象同 Wang et al.(2006)和沈恒勝等(2004)的研究結(jié)果基本吻合。

圖1 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻生長發(fā)育過程中纖維素含量動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes in cellulose content in transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins at their different growth and developmental stages

圖2 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻生長發(fā)育過程中半纖維素含量動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes in hemi-cellulose content in transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins at their different growth and developmental stages

2.3 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻木質(zhì)素含量分析

廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8及其相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因水稻七絲軟粘在進(jìn)入抽穗期后，其葉片、葉鞘和莖的木質(zhì)素含量均有不同程度的上升趨勢，且各個生育期木質(zhì)素含量都表現(xiàn)為葉片、葉鞘＞莖(圖3)。沈恒勝等(2001)認(rèn)為，稻草中木質(zhì)素含量同硅化物的含量具有顯著相關(guān)性，而水稻硅化物分布又具有隨生長發(fā)育向外、向上傳輸?shù)奶匦裕氏鄬τ谌~片和葉鞘，莖的木質(zhì)素含量較低。

木質(zhì)素的降解是真菌、細(xì)菌及相應(yīng)微生物群落共同作用的結(jié)果，其中真菌起主要作用。分析結(jié)果表明，除孕穗期的葉鞘及成熟期的莖外，供試廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻各部位的木質(zhì)素含量與相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因水稻相比均不存在顯著差異(P＞0.05)。由此可推測，廣譜抗真菌蛋白基因的導(dǎo)入對秸稈木質(zhì)素的含量和分布沒有較大的影響。

2.4 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻粗蛋白質(zhì)含量分析

從圖4可知，七絲軟粘葉片、葉鞘和莖的粗蛋白質(zhì)含量均在分蘗期最高，分別為23.4%、10.4%和17.1%;之后逐步下降，成熟期達(dá)到最低，分別為11.8%、5.8%和 3.0%。轉(zhuǎn)品 1、轉(zhuǎn)品 8 與七絲軟粘的葉片、葉鞘和莖粗蛋白質(zhì)含量變化趨勢一致。水稻在營養(yǎng)生長和生殖生長過程中都需要大量的蛋白質(zhì)來滿足細(xì)胞組織的更新和修補(bǔ)，這可能是導(dǎo)致粗蛋白質(zhì)含量持續(xù)降低的原因。對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗表明，轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8與七絲軟粘的蛋白質(zhì)含量差異不顯著(P＞0.05)。這在一定程度上反映了廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻的營養(yǎng)品質(zhì)與其相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因品種具有相似性。

圖3 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻生長發(fā)育過程中木質(zhì)素含量動態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes in lignin content in transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins at their different growth and developmental stages

圖4 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻生長發(fā)育過程中粗蛋白質(zhì)含量動態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of crude protein content during the growth and development in transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins plants at different growth stages

2.5 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻組織顯微結(jié)構(gòu)觀察

供試水稻品種的葉片表面均含有許多大小不一的硅質(zhì)瘤狀結(jié)構(gòu)，這些硅質(zhì)瘤狀結(jié)構(gòu)分布在葉片不同的部位，包括氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞上(圖5A～C)。分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8及七絲軟粘的硅質(zhì)瘤狀結(jié)構(gòu)排列形狀變化趨向一致，致密程度無明顯差異。此外，各品種間葉表皮的氣孔排列致密程度接近，每個氣孔周圍均分布了4～8個呈簇狀排列、尖端向心性的硅質(zhì)瘤狀結(jié)構(gòu)。

用掃描電鏡觀察莖稈組織(圖5D～F)顯示，廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻與相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因水稻莖稈的形態(tài)結(jié)構(gòu)基本相似，莖壁、厚壁組織、薄壁組織以及維管束等結(jié)構(gòu)的形態(tài)和所占面積比例基本一致，大、小維管束的數(shù)目、分布密度及面積大小等也無明顯差異，且各水稻品種莖稈的薄壁組織細(xì)胞中均貯藏著豐富的木質(zhì)素以及淀粉等多糖顆粒。由此可見，廣譜抗真菌基因的轉(zhuǎn)入對水稻的組織形態(tài)沒有影響。

圖5 廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏慕M織顯微結(jié)構(gòu)Fig.5 The microstructure of leaf and stem tissue of transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins plants and its nontransgenic counterpart under scanning electron microscope(SEM)

3 討論

廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻盡管對真菌病害具有明顯抗性，可以大幅度提高水稻產(chǎn)量，但人們對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的食用安全性及其對生態(tài)環(huán)境的影響存在疑慮。將轉(zhuǎn)基因作物及來源的食品與非轉(zhuǎn)基因同源對照物在表型、農(nóng)藝性狀、組成成分等方面進(jìn)行詳細(xì)的比較，從而得出轉(zhuǎn)基因作物與非轉(zhuǎn)基因同源對照物是否具有實質(zhì)等同性結(jié)論的工作被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因作物安全性評價的重要起始點(賀曉云等，2008)。李英華等(2004)對轉(zhuǎn)入抗水稻白葉枯病Xanthomonas oryzae pv.oryzae Dye Xa21基因的轉(zhuǎn)基因大米進(jìn)行營養(yǎng)成分分析時，發(fā)現(xiàn)當(dāng)轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因水稻種植條件完全相同時，營養(yǎng)成分無差異。Han et al.(2005)對轉(zhuǎn)入豇豆胰蛋白酶抑制劑基因的水稻及其親本的主要營養(yǎng)成分(水分、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、碳水化合物、纖維、灰分、各類脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)等)進(jìn)行了詳細(xì)的分析和比較，結(jié)果顯示除脂肪和脂肪酸有細(xì)微的區(qū)別外，其他成分均無差異。Li et al.(2007)同樣對轉(zhuǎn)sck和cry1AC基因的抗蟲水稻與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ者M(jìn)行了細(xì)致的營養(yǎng)成分等同性分析，結(jié)果認(rèn)為轉(zhuǎn)基因水稻與對照在主要營養(yǎng)成分上具有實質(zhì)等同性。但是，這些分析采用的都是稻米的數(shù)據(jù)，僅強(qiáng)調(diào)了食用安全的評價，而忽視了轉(zhuǎn)基因水稻對環(huán)境的安全性評價。

本研究對廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8及其相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因水稻七絲軟粘在整個生長發(fā)育過程中各植物學(xué)部位(葉片、葉鞘、莖)的主要化學(xué)成分，包括半纖維素、纖維素、木質(zhì)素以及粗蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行了測定和分析。結(jié)果顯示，在整個生長發(fā)育過程中，轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8各植物學(xué)部位的化學(xué)成分含量變化趨勢與對照七絲軟粘基本一致。水稻葉面的“硅質(zhì)化”特殊結(jié)構(gòu)以及莖稈的粗細(xì)，大、小維管束數(shù)目和莖壁厚度等物理特性都已被證明與水稻抵抗病菌和害蟲侵害的能力有著密切的關(guān)系(楊秉耀等，2006;Belanger et al.，1995;Fidanza＆ Dernoeden，1996;張上都等，2010)。故本研究利用掃描電鏡觀察了成熟期轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8及對照七絲軟粘的組織顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)廣譜抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化，與其相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因水稻基本一致。因此，認(rèn)為廣譜抗真菌幾丁質(zhì)酶基因和葡聚糖酶基因的導(dǎo)入未引起水稻植株化學(xué)成分組成和組織顯微結(jié)構(gòu)的明顯變化。據(jù)報道，秸稈的化學(xué)成分組成與秸稈的降解消化有密切的相關(guān)性(Keys＆DeBarthe，1974)。

轉(zhuǎn)基因水稻安全性評價工作是復(fù)雜的系統(tǒng)性工程。本研究僅是轉(zhuǎn)基因水稻環(huán)境安全性評價的起步，有關(guān)其食用安全性以及對生態(tài)環(huán)境的影響等還有待于進(jìn)一步探索試驗。

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