崔東紅 江開達

·專家論壇/Seminar·

精神分裂癥的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究

崔東紅 江開達

全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study,GWAS）是指采用高通量的基因分型技術(shù)，對覆蓋全基因組的遺傳標志進行基因分型，通過病例對照研究或基于家系的關(guān)聯(lián)分析來尋找全基因組中與疾病（性狀）相關(guān)的基因。目前廣泛用于復雜遺傳疾病研究的GWAS已在多種疾病中取得了重大突破，精神分裂癥作為復雜遺傳疾病的典型代表，GWAS發(fā)現(xiàn)了許多新的精神分裂癥候選致病基因，GWAS研究雖然有良好的應(yīng)用前景，但也存在一些缺陷，如多次假設(shè)檢驗造成的假陽性結(jié)果。本文就GWAS的特點和存在的問題及其在精神分裂癥研究中的應(yīng)用進展做一綜述。

精神分裂癥 全基因組關(guān)聯(lián)分析

全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS)是指采用高通量的基因分型技術(shù)，對覆蓋全基因組的遺傳標志進行基因分型，通過病例對照研究或基于家系的關(guān)聯(lián)分析來尋找全基因組中與疾?。ㄐ誀睿┫嚓P(guān)的基因。目前廣泛用于復雜遺傳疾病研究的GWAS已在多種疾病中取得了重大突破，精神分裂癥作為復雜遺傳疾病的典型代表，GWAS為其研究帶來了良好的前景。本文就GWAS的特點及其在精神分裂癥研究中的應(yīng)用進展做一綜述。

1 GWAS的由來

尋找疾病基因的傳統(tǒng)方法基本可歸為兩類：連鎖分析和候選基因關(guān)聯(lián)分析。連鎖分析在單基因遺傳疾病研究中非常實用［1］，但對于精神分裂癥這種復雜遺傳性疾病來說收效甚微。對檢測微效基因，關(guān)聯(lián)分析比連鎖分析能夠提供更大的統(tǒng)計效力［2］，但在GWAS出現(xiàn)前這種方法僅限于研究候選基因而不能發(fā)現(xiàn)候選基因之外的新致病基因［3］。2003年HapMap計劃的正式啟動和基因分型成本的降低使得大樣本全基因組水平基因分型成為可能，GWAS應(yīng)運而生。

與以往候選基因關(guān)聯(lián)分析策略明顯不同的是，GWAS不再需要在研究之前構(gòu)建任何假設(shè)（hypothesis-free）,即不需要預先依據(jù)那些尚未充分闡明的生物學基礎(chǔ)來假設(shè)與疾病相關(guān)候選基因。GWAS結(jié)合了關(guān)聯(lián)分析檢測到微效基因效力較強和連鎖分析可以對發(fā)病機制不明的疾病進行染色體粗略定位的優(yōu)點［4］，在整個基因組水平研究DNA的變異，以發(fā)現(xiàn)低致病風險的常見等位基因。因此，目前GWAS已經(jīng)被廣泛用于復雜遺傳疾病的研究。

2 GWAS研究的遺傳標記

GWAS主要使用的遺傳標記是單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）和剛剛興起的第四代遺傳標記拷貝數(shù)變異（copy number variation,CNV）。SNP是人類基因組中最常見的遺傳變異，因其結(jié)構(gòu)簡單，便于高通量分析，被廣泛應(yīng)用于GWAS研究中。但是，作為單個堿基變異，SNP不能完全解釋人類復雜疾病的遺傳易感性。CNVs是指較之于參照基因組，DNA片段缺失、插入或復制大于l kb的結(jié)構(gòu)變異。CNVs在整個基因組中覆蓋的核苷酸總數(shù)大大超過SNP的總數(shù)，且大片段CNV可以影響兩個或更多相鄰基因，從而導致多基因缺失，進而引起綜合征型疾病或復雜疾病，所以CNV的全基因組關(guān)聯(lián)分析更容易鑒定到致病突變［5］。

3 精神分裂癥的GWAS的現(xiàn)狀以及進展

3.1 早期混合樣本分型法

早期的GWAS研究考慮降低基因分型的費用，多采用基因池（DNA pool）法，即把多個樣本的DNA合并后，用基因芯片進行基因分型。Mah等［6］（2006）率先采用了這種方法進行GWAS研究，并發(fā)現(xiàn)位于1q32的PLXNA2基因與精神分裂癥相關(guān)（OR=1.49,P=0.006）。隨后Shifman等［7］（2008）、Kirov等［8］（2009）分別發(fā)現(xiàn)絡(luò)絲蛋白（reelin,RELN）與女性精神分裂癥相關(guān)，視黃醇結(jié)合蛋白1（RBP1）基因的rs893703與精神分裂癥有關(guān)聯(lián)。由于以上研究是將病例和對照樣本的DNA分別合并后（DNA pool）進行分型，使其效能差于單個樣本基因分型法［4］。

3.2 單個樣本分型法

Lenez等［9］第一個發(fā)表了基于單個樣本基因分型（individual genotyping）的GWAS研究，發(fā)現(xiàn)CSF2RA基因附近的SNP rs4129148與精神分裂癥相關(guān)。但這一結(jié)果并未得到重復驗證。2008年，另有學者發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子鋅指蛋白804A（ZNF804A）附近的一個SNP rs1344706（2q32.1）與精神分裂癥較強關(guān)聯(lián)（OR=1.12,P=1.6×10-7）。ZNF804A在背外側(cè)前額皮質(zhì)（DLPFC）與海馬的連接、左右大腦半球的連接以及背外側(cè)前額皮質(zhì)與杏仁核的連接上有重要作用。因此，ZNF804A可能是精神分裂癥的易感基因。

Stefansson等［10］發(fā)現(xiàn)了位于MHC（major histocompatibility complex）區(qū)域（6p21.3-22.1）的三個基因的SNP（HIST1H2BJ, rs6913660；NOTCH4,rs3131296；PRSS16,rs6932590）和位于11q24.2的neurogranin（NRGN）基因的SNP（rs12807809）及位于18q21.2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子4基因（TCF4）的SNP（rs9960767）與精神分裂癥在全基因組水平上顯著相關(guān)。NRGN基因編碼突觸后蛋白激酶，并廣泛表達在與認知功能相關(guān)的大腦區(qū)域，TCF4參與大腦發(fā)育，而精神分裂癥患者存在相關(guān)功能缺陷。這些發(fā)現(xiàn)提示免疫系統(tǒng)可能通過MHC參與精神分裂癥的發(fā)病。

Athanasiu等［11］發(fā)現(xiàn)三個SNP與精神分裂癥相關(guān)，它們分別是位于PLAA基因的rs7045881（9p21）；ACSM1的rs433598（6p12.3）和ANK3的rs10761482（10q21）。PLAA參與炎癥反應(yīng)和膜的完整性，ACSM1與內(nèi)分泌功能和血脂異常有關(guān)，ANK3參與細胞運動和增殖及特定部位的接觸和維護。在一項Meta分析中，ANK3也被認為與雙相障礙有關(guān)［12］。Djurovic等［13］利用芯片對挪威人雙相障礙、健康對照、精神分裂癥患者的620 390個SNP進行分型，發(fā)現(xiàn)雙相障礙與精神分裂癥的候選基因有著一定程度的重疊，這也支持遺傳風險超出描述性疾病診斷的界限這一假設(shè)。

2011年，精神分裂癥其他角度的GWAS也相繼開展。例如Alkelai等［14］在一個基于家系的GWAS研究中發(fā)現(xiàn)DOCK4基因與精神分裂癥相關(guān)（rs2074127,P=1.134× 10-7）；國人開展的一項GWAS研究中發(fā)現(xiàn)位于8號染色體上的MSRA基因與精神分裂癥有關(guān)［15］。McClay等［16］還進行了精神分裂癥的藥物基因組學的GWAS研究以在抗精神病藥物反應(yīng)方面篩查候選基因等。

目前國際上已有十數(shù)項精神分裂癥的GWAS研究（見表1），因精神分裂癥的病因比較復雜，雖然我們難以從龐雜的GWAS結(jié)果得到清晰一致的思路，但從以上研究也可以看出其發(fā)病機制主要涉及免疫、神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)連接等方面。面對精神分裂癥的機制，我們不排斥多元論的解釋，但目前多元論解釋往往是各自獨立的，尚未形成一個具有有機聯(lián)系的假說。要改變這種狀況，關(guān)鍵在科學技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上依靠系統(tǒng)研究的原則對其展開綜合研究。

4 GWAS在精神分裂癥的應(yīng)用中存在的缺陷［17］

雖然GWAS研究發(fā)現(xiàn)在很大程度上加深了人們對精神分裂癥分子遺傳機制的理解，但也顯現(xiàn)出很大的局限性，這些缺陷不僅體現(xiàn)在GWAS這種方法本身，如需要大樣本量、多重假設(shè)檢驗、人群分層等帶來的結(jié)果分析誤差，還體現(xiàn)在它在精神分裂癥中的應(yīng)用方面。

疾病的遺傳度表示疾病或表型在多大程度上受遺傳因素的影響，遺傳度較低的表型會降低關(guān)聯(lián)研究的檢驗效能。因此，進行GWAS時，應(yīng)盡可能選擇那些可定量反映疾病危險的指標、可用于分析疾病臨床亞型的特征，或可用于診斷和鑒別診斷疾病的高遺傳度的表型特征。內(nèi)表型，如神經(jīng)影像、電生理、神經(jīng)心理、生物化和其他的標記，或許能夠反映出潛在的基因效應(yīng)，但通常這些測量方式在大的樣本中不容易采用。

表1.精神分裂癥的GWAS研究

精神分裂癥作為一種復雜的多基因遺傳病，所有的風險基因可能僅有較低的相對危險性或者是基因的致病風險是由于大量的罕見的SNPs或CNVs引起，而常見變異又因作用太微弱而不能有效的被檢測到。因此，GWAS研究只有在很大樣本中才可能有所發(fā)現(xiàn)。而且當今的基因分型技術(shù)可能會遺漏潛在的重要遺傳變異，如大量的罕見變異、插入-缺失多態(tài)性等非SNP遺傳變異。遺傳異質(zhì)性可降低檢驗效能，而增大樣本量往往加劇遺傳異質(zhì)性問題。

對精神分裂癥的GWAS研究的對照組的選擇需十分慎重。在對照組中混有一些達不到疾病診斷標準但有前驅(qū)癥狀的邊緣狀態(tài)的情況，會造成結(jié)果的誤差，比如說沒有臨床表現(xiàn)的發(fā)育障礙。GWAS研究需要大樣本的對照組，因此，需采用多種方法評估對照組來確定其相對“健康”。

GWAS未能對基因—環(huán)境相互影響進行很好的分析，有可能忽略環(huán)境因素的影響，從而過高估計遺傳因素在發(fā)病機制中的作用。此外，精神分裂癥疾病本身也許涉及了尚未知曉的遺傳機制。我們現(xiàn)在僅僅認識到了CNV、微小RNAs、遠程啟動子（long-range promoters）和表觀遺傳學因素，還有許多的功能序列還尚未發(fā)現(xiàn)。因此，基于CNV、SNP基因分型的GWAS不能揭示那些尚未知曉的遺傳機制。

5 結(jié)語

占據(jù)精神疾病遺傳學研究領(lǐng)域數(shù)十年的主要手段——候選基因關(guān)聯(lián)分析，雖然發(fā)現(xiàn)許多有價值的精神分裂癥候選風險基因，但這對于在人類龐大的基因數(shù)目中尋找這種多基因疾病的致病基因無異于大海撈針。所以，我們迫切需要一個全新的研究手段能覆蓋所有基因，并且能高通量、自動化進行分析。GWAS正是這樣一種研究手段。自GWAS問世的短短幾年間，精神分裂癥的GWAS研究發(fā)現(xiàn)了許多以前未知的癥狀或疾病相關(guān)的染色體區(qū)域，加深了我們對精神分裂癥分子遺傳機制的理解，然而，現(xiàn)在GWAS方法還并不十分完善，主要是太依賴于統(tǒng)計分析，以至于假陽性和假陰性結(jié)果還是比較多，造成目前很多研究都沒有取得良好的重復性結(jié)果，而且難以從龐雜的GWAS結(jié)果得到清晰的思路：幾乎所有已發(fā)現(xiàn)的SNP僅輕度增加疾病風險，對闡明疾病遺傳特征作用甚微；一些SNP僅與疾病危險因子或誘發(fā)因子有關(guān)而非直接與疾病關(guān)聯(lián)。但是，不難預見，通過這種技術(shù)，我們可以快速簡便地將基因組中的遺傳差異（基因型）與表現(xiàn)型聯(lián)系起來，將找出的與疾病表型最相關(guān)的差異位點群作為診斷或預測這種疾病的生物標記，為后續(xù)研究打下了很好的基礎(chǔ)。尤其是伴隨著新一代測序技術(shù)的產(chǎn)生，這種GWAs分析有著非常好的應(yīng)用前景，比如不基于疾病假說的疾病候選基因的全面篩查、發(fā)現(xiàn)致病基因通路以及基于疾病分析的個體化醫(yī)療等等。

GWAS還只是剛剛起步，但已為研究人類復雜遺傳性疾病揭開了新的序幕，相信隨著GWAS相關(guān)方法和技術(shù)的進一步深入發(fā)展，它將成為研究精神分裂癥的強有力的武器。有理由預見，在多學科的合作下，精神疾病的遺傳學研究能得到大大突破。

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Research in schizoPhrenia using genome-wide association study methodology

Donghong CUI，Kaida JIANG*
Shanghai Mental Health Center，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200030，China*Correspondence：jiangkaida@yahoo.com.cn

The genome-wide association study(GWAS)methodology uses high-throughput genotyping technology to genetically classify the hereditary characteristics of the entire genome.Case-control studies or family lineage studies that employ GWAS analyses can identify specific genes associated with diseases or traits.The wide use of this technique to assess genetically complex diseases has already led to major advances in several diseases.The use of GWAS in the study of schizophrenia—a typical example of a genetically complex disease—has identified several new candidate genes.Despite the potential utility of the GWAS methodology，it has some limitations such as the increased risk of false-positive results due to the large number of hypotheses being tested.This overview discusses the benefits and problems in the use of the GWAS methodology and summarizes the progress in the application of this methodology in research about schizophrenia.

Schizophrenia;Genome-wide Association Study

10.3969/j.issn.1002-0829.2011.05.001

上海交通大學醫(yī)學院附屬精神衛(wèi)生中心200030。通信作者：江開達，電子信箱jiangkaida@yahoo.com.cn