劉菊華，鄧成菊，3，金志強(qiáng)，2，謝學(xué)立,賈彩紅，張建斌，徐碧玉

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所∥農(nóng)業(yè)部熱帶生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,海南 ?？?571101；2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？谠囼?yàn)站∥香蕉研究所,海南 海口 570102；3. 云南省紅河熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,云南 紅河 661300)

甲基乙二醛(Methylglyoxal,MG)是一種細(xì)胞毒素的代謝物，MG產(chǎn)生于糖酵解、氨基酸分解代謝、丙酮的正常代謝和環(huán)境逆境脅迫，在微生物，酵母，動(dòng)物以及高等植物中都存在[1]。甲基乙二醛及其他包括乙二醛等在內(nèi)的α羰基醛類可在體內(nèi)通過(guò)糖化作用與蛋白質(zhì)、核酸形成共價(jià)化合物，生成果糖胺和高度糖化終產(chǎn)物(advancedglycation end products，AGE)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

乙二醛酶(glyoxalase,GLO)途徑包括兩個(gè)酶，即乙二醛酶I(GLO I)和乙二醛酶II(GLOII)，是一種胞內(nèi)酶，普遍存在于各種細(xì)胞器中，尤其是線粒體中，它的活性貫穿整個(gè)生命的始終。生物體內(nèi)對(duì)甲基乙二醛的代謝主要是在GLO I的作用下將MG和谷胱甘肽(glutathione,GSH)縮合生成S-D-乳酸谷胱甘肽,降低MG的生理活性濃度，接著在GLOII的作用下將S-D-乳酸谷胱甘肽水解成無(wú)毒的GSH和D-乳酸[2]。

目前，在很多植物中分離到乙二醛酶I，如大豆[3]、莧菜[4]、小麥[5]、水稻[6]等。乙二醛酶基因的克隆及功能研究也有了相關(guān)報(bào)道， Bhomkar 等[7]用35 S啟動(dòng)子啟動(dòng)乙二醛酶I基因在煙草中過(guò)量表達(dá)能增強(qiáng)植株葉片抗衰老的能力，用夜香樹(shù)黃葉卷曲病毒(Cestrum yellow leaf curling virus ，CmYLCV)啟動(dòng)子啟動(dòng)乙二醛酶基因在豇豆中過(guò)量表達(dá)也能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的抗鹽性。Lin 等[5]用禾谷鐮刀菌侵染麥穗誘導(dǎo)了小麥乙二醛酶I基因的表達(dá)，同時(shí)也受高濃度的NaCl和ZnCl2的誘導(dǎo)。將小麥乙二醛酶基因轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)100 mmol/L的NaCl和20 mmol/L的ZnCl2具有高度忍耐性。Roy 等[8]在擬南芥中用鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子(rd29A)過(guò)量表達(dá)芥菜乙二醛酶I基因，轉(zhuǎn)基因擬南芥能在150 mmol/L的NaCl脅迫下正常存活。Singla-Pareek 等[6]研究指出在水稻中過(guò)量表達(dá)水稻乙二醛酶II基因，轉(zhuǎn)基因水稻乙二醛酶II的活性維持在一個(gè)很高的水平，并表現(xiàn)出對(duì)鹽和MG脅迫的忍耐性，且在鹽脅迫下表現(xiàn)出持續(xù)生長(zhǎng)和維持良好的離子平衡。但總體從植物中克隆的乙二醛酶基因數(shù)量較少，除了耐鹽性以外，其它功能了解甚少。

香蕉是重要的熱帶水果之一，是喜高溫，怕低溫的作物，溫度和水分是香蕉分布的主要限制因子。溫度首先影響香蕉的生長(zhǎng)速度，當(dāng)氣溫低于15 ℃時(shí)，香蕉的生長(zhǎng)會(huì)受到很大的影響，當(dāng)氣溫低于10 ℃時(shí)，生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制。香蕉無(wú)主根，而且是肉質(zhì)根，葉面積大，生長(zhǎng)期對(duì)水的需求量也大，但是香蕉的根系生長(zhǎng)與活動(dòng)需要充足的氧氣，這決定了香蕉喜濕熱氣候，在土層深、土質(zhì)疏松、肥沃、排水良好的地里生長(zhǎng)比較旺盛。然而，由于全球異常氣候的增多，香蕉處于高溫、低溫、干旱、鹽堿、風(fēng)害等逆境的時(shí)間也增多，這嚴(yán)重影響了香蕉產(chǎn)量并制約著香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)室采用抑制縮減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)方法分離了在香蕉采后成熟早期差異表達(dá)的低豐度cDNA序列，獲得289個(gè)重組克隆[9]。NCBI BlastX 結(jié)果顯示,其中有一個(gè)496 bp的片段與其他物種的GLO基因序列相似。本研究通過(guò)RACE技術(shù)，獲得了MaGLO14全長(zhǎng)，通過(guò)對(duì)該基因在不同逆境處理下的表達(dá)分析及轉(zhuǎn)化煙草研究其與香蕉非生物脅迫的關(guān)系及可能的功能。

1 材料和方法

1.1 材料

香蕉根、莖、葉、花、果實(shí)均來(lái)自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所香蕉種植園。將采收的根、球莖、葉、花用無(wú)菌水清洗并用w=1‰的次氯酸鈉表面消毒，立即在液氮中冷凍。將采收的香蕉果實(shí)立即切割成單果指，用無(wú)菌水清洗并用w=1‰的次氯酸鈉表面消毒，放入22 ℃恒溫箱正常成熟。當(dāng)天處理的果實(shí)即為采后0 d，隔2 d取材，將樣品切割成塊立即用液氮冷凍，放入-70 ℃冰箱中保存，以備RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 香蕉根、莖、葉、花、果實(shí)RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 按照Wan和Wilkins[10]的方法，從香蕉根、莖、葉、花和采后不同時(shí)間的果實(shí)中提取總RNA。每個(gè)樣品取4 μg RNA，利用Invitrogen SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase 合成cDNA第一鏈。

1.2.2MaGLO14 c DNA克隆 根據(jù)SSH文庫(kù)所獲得的該基因的片段設(shè)計(jì)了5′-RACE引物(5′AAGAAGCTCCATACCAAATGC 3′)和3′-RACE引物(5′ATAGCGATGATGGGATACGGT 3′)， RACE PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性1 min; 94 ℃變性5 s,68 ℃退火10 s,循環(huán)35次；72 ℃延伸13 min。

參照美國(guó)Clontech公司的SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)，以香蕉采后正常成熟2 d的RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，利用RACE技術(shù)克隆MaGLO14 cDNA的5′和3′端。PCR產(chǎn)物經(jīng)w=1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收該片段,連接到pMD18-T載體，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單菌進(jìn)行PCR鑒定。將鑒定的陽(yáng)性克隆測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)和拼接得到基因全長(zhǎng)cDNA序列。

再根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)5′引物(5′TACGCCATGGGACGAGGTCGAAGACAGGA 3′)和3′引物(5′ ATGTACTAGTGATAACAAGGGCGGAATAC 3′)，以香蕉果實(shí)正常成熟2 d的cDNA第一鏈為模板，克隆MaGLO14的全長(zhǎng)cDNA。

1.2.3MaGLO14在香蕉不同器官的表達(dá)分析 以香蕉根、莖、葉、花和果實(shí)采后2 d的 cDNA為模板，采用RT-PCR方法對(duì)其進(jìn)行器官特異性表達(dá)分析。

MaGlO14的RT-PCR引物為5′引物(5′GGAAAGGTCCATCAAGTT3′)和3′引物(5′ACAGGGCAATCTCAGGTA3′)。內(nèi)參Actin選用NCBI上已登錄的香蕉Actin基因(基因登陸號(hào)：EF672732)，引物為P1(5′-CGAGGCTCAATCAAAGA-3′)和P2(5′-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3′)。RT-PCR的反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min; 95 ℃變性15 s,56 ℃退火15 s,72 ℃延伸20 s,循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)MaGLO14在香蕉非生物脅迫下的表達(dá) 將五葉一心的香蕉幼苗進(jìn)行干旱[11]、鹽脅迫[12]、低溫[13]、澇害脅迫(將香蕉幼苗根部全部浸入水中，淹水處理6,12,24,36 h,定期取直徑為1 mm左右白色新嫩根，迅速吸干根表面水分，立即液氮速凍，置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。以淹水處? h的樣品為對(duì)照。)和乙烯利(用φ=40 %的乙烯利稀釋200倍噴灑香蕉幼苗，直到葉尖滴下液滴為止，按照6、12和24 h取樣，切成小塊置于液氮中速凍，保存于-70 ℃。)等不同的非生物脅迫處理，提取不同處理?xiàng)l件下不同處理階段的幼苗葉片或根的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈后作為模板。所用的MaGLO14引物和內(nèi)參Actin1引物、RT-PCR反應(yīng)程序同1.2.3。

1.2.5MaGLO14轉(zhuǎn)化煙草及鑒定 以pCAMBIA1304載體為基礎(chǔ)，將不包含終止密碼子的MaGLO14的cDNA片段插入到35 S啟動(dòng)子的下游，GFP基因的上游，使MaGLO14與GFP形成融合蛋白，由35 S啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)。命名為pCAMaGLO14。煙草轉(zhuǎn)化參考Singla-Pareek方法。以植物表達(dá)載體pCAMaGLO14中的MaGLO14基因序列設(shè)計(jì)5′端引物，綠色熒光蛋白基因上設(shè)計(jì)3′端引物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)，引物的擴(kuò)增片段大小為1 047 bp。在PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株中隨機(jī)挑選6株，提取其基因組DNA，用EcoRI對(duì)其進(jìn)行酶切，標(biāo)記MaGLO14接近3′端一段cDNA序列作為探針， 進(jìn)行Southern blot分析。

挑選Southern blot信號(hào)最強(qiáng)的編號(hào)5號(hào)的轉(zhuǎn)基因煙草，參照Singla-Pareek(2007)方法進(jìn)行體外葉片耐鹽實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果和分析

2.1 MaGLO14cDNA克隆與生物信息學(xué)分析

根據(jù)RACE擴(kuò)增結(jié)果拼接獲得全長(zhǎng)1 286 bp 的序列，通過(guò)ORF Finder和GENACAN 軟件分析表明該cDNA序列有一個(gè)翻譯起始密碼子ATG,相同讀碼框內(nèi)有一個(gè)終止密碼子TGA,表明此序列具有一個(gè)完整的ORF，編碼358個(gè)氨基酸。隨后，設(shè)計(jì)2條引物，從正常成熟2 d的RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈模板中克隆到1 195 bp的基因全長(zhǎng)。

BlastX分析表明，MaGLO14基因?qū)儆谝叶┟窱類基因，其推導(dǎo)的氨基酸序列與云杉(ABK22263)、葡萄(CBI23235)、葡萄柚(CAB09799)、棉花(ACJ11750)和蓖麻(EEF43857)有較高的一致性，分別為82%、83%、82%、80%、82%(圖1)。

圖1 不同植物的MaGLO14基因推導(dǎo)的氨基酸序列比較

分子進(jìn)化樹(shù)分析表明，MaGLO14cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列與云杉的進(jìn)化關(guān)系最近，與蕓苔、葡萄柚、毛果楊、葡萄、棉花的進(jìn)化關(guān)系次之，與苜蓿、擬南芥、蓖麻的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)(圖2)。

圖2 MaGLO14的分子進(jìn)化樹(shù)分析

2.2 MaGLO14 器官特異性表達(dá)分析

從圖3可知，MaGLO14基因在香蕉根、莖、葉、花、果實(shí)中均有表達(dá)。是一個(gè)組成型表達(dá)的基因，推測(cè)該基因可能在香蕉的不同器官中發(fā)揮作用。

圖3 MaGLO14的器官特異性表達(dá)分析

2.3 RT-PCR檢測(cè)MaGLO14在不同非生物脅迫處理下的表達(dá)

圖4表明,MaGLO14 在干旱脅迫誘導(dǎo)條件下呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，表達(dá)水平與干旱處理的時(shí)間沒(méi)有明顯的相關(guān)性； 300 mmol/L的NaCl脅迫下，處理2 h，MaGLO14表達(dá)略有降低，處理4h時(shí)該基因表達(dá)達(dá)到一個(gè)峰值，隨后又下降；溫度從常溫降低到10 ℃，MaGLO14的表達(dá)沒(méi)有明顯的差異，但隨著溫度的進(jìn)一步降低到7 ℃、5 ℃，基因的表達(dá)水平明顯上升達(dá)到較高水平；在澇害(即缺氧)脅迫下，基因呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)；乙烯利處理香蕉幼苗，處理后6 h,基因表達(dá)增強(qiáng)，處理12 h后表達(dá)達(dá)到峰值，處理24 h后基因表達(dá)略有下降，但還保持在較高水平。

圖4 MaGLO14在不同非生物脅迫下的表達(dá)分析

2.4 轉(zhuǎn)MaGLO14 煙草分子檢測(cè)及耐鹽鑒定

PCR檢測(cè)共獲得36株陽(yáng)性煙草植株。隨機(jī)挑選6株進(jìn)行southern blot 鑒定，結(jié)果顯示2、4、5、6株系檢測(cè)到了雜交信號(hào)，表明MaGLO14已整合到這4個(gè)植株的基因組中(圖5)。用去離子水作為對(duì)照與400 mmol/L和800 mmol/L的NaCl溶液分別處理野生型煙草和編號(hào)為5的轉(zhuǎn)基因煙草離體葉片，結(jié)果顯示用400 mmol/L和800 mmol/L的NaCl的溶液處理煙草葉片，處理2 d轉(zhuǎn)基因植株的葉片受傷害的程度明顯比野生型輕，800 mmol/L的NaCl的溶液處理的野生型煙草葉片有輕微失綠和明顯褐化斑點(diǎn)，受傷害程度最重。處理3 d，野生型煙草葉片呈現(xiàn)失綠和嚴(yán)重褐化，而轉(zhuǎn)基因的煙草葉片只是因?yàn)闈B透失水而表現(xiàn)為葉盤(pán)上卷，并沒(méi)有表現(xiàn)明顯的組織壞死(圖6 a)。RT-PCR檢測(cè)400 mmol/L和800 mmol/L的NaCl溶液處理煙草葉片MaGLO14表達(dá)，轉(zhuǎn)基因煙草基因表達(dá)量明顯增強(qiáng)(圖6 b)。

同時(shí)測(cè)定其葉綠素的含量，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草用不同濃度的NaCl溶液處理離體葉片2或3 d，轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量明顯比野生型煙草葉綠素含量高(圖7)。

圖5 轉(zhuǎn)MaGLO14的煙草植株的Southern blot分析

圖6 轉(zhuǎn)MaGLO14的煙草植株葉片的耐鹽性分析

圖7 轉(zhuǎn)MaGLO14的煙草和野生型植株葉片的葉綠素質(zhì)量濃度分析

3 討 論

根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，本研究所分離得到的MaGLO14基因在分子進(jìn)化上與云杉具有較親的關(guān)系，其推導(dǎo)的氨基酸序列與蕓杉、蕓苔、葡萄、葡萄柚、棉花等都具有較高的相似性。采用PredictProtein軟件分析發(fā)現(xiàn)該基因存在GlyoxalaseI的極為保守結(jié)構(gòu)域，此外還具有3個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)酪氨酸激酶II磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)糖基化位點(diǎn)、2個(gè)蛋白激酶C的磷酸化位點(diǎn)和4個(gè)豆蔻酰化位點(diǎn)[14]。這些功能性位點(diǎn)的存在是MaGLO14基因行使其正常的生理功能所必需的。

植物乙二醛酶基因的功能研究主要集中在耐鹽方面。Espartero 等研究了編碼番茄的一個(gè)乙二醛酶I基因GLX1，用NaCl脅迫處理番茄植株，根、莖、葉中該基因在mRNA和氨基酸水平上提高了兩到三倍[15]。Lin等用100 mmol/L的NaCl處理小麥幼苗，乙二醛酶基因表達(dá)比用水處理表達(dá)量約高兩倍。在轉(zhuǎn)基因方面也證實(shí)該基因具有增強(qiáng)植物耐鹽性[5]。植物在脅迫條件下保持葉綠素含量的能力可以作為植物受到傷害的一個(gè)指標(biāo)。Singla-Pareek等在煙草中過(guò)量表達(dá)芥菜乙二醛酶II基因，轉(zhuǎn)基因煙草比野生型煙草具有更強(qiáng)的耐鹽能力，用400 mmol/L和800 mmol/L的NaCl處理離體葉片，野生型煙草比轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素降解更快[6]。Bhomkar等在豇豆中過(guò)量表達(dá)芥菜乙二醛酶I基因，用NaCl (400與600 mmol/L) 處理離體豇豆葉片轉(zhuǎn)基因豇豆葉片衰老比野生型豇豆衰老慢，葉綠素降解也比野生型慢[7]。我們轉(zhuǎn)MaGLO14煙草在氯化鈉處理下基因上調(diào)表達(dá)，轉(zhuǎn)基因煙草離體葉片氯化鈉處理結(jié)果也顯示比野生型煙草具有更高的忍耐性，轉(zhuǎn)基因煙草鹽脅迫下比野生型煙草葉片含有更高的葉綠素。說(shuō)明香蕉的MaGLO14過(guò)量表達(dá)以后確實(shí)可以提高植物的耐鹽性，這與前人的研究結(jié)果是一致的。

在本研究中該基因在低溫、乙烯利脅迫下上調(diào)表達(dá)，而在干旱、水分脅迫下下調(diào)表達(dá)。這些表達(dá)特性顯示在以上相關(guān)的脅迫過(guò)程中，MaGLO14都具有重要的作用。而這些特性在其他植物乙二醛酶I的研究中尚未見(jiàn)報(bào)道，我們推測(cè)這可能和乙二醛酶I作用底物的非專一性有關(guān)，如甲基乙二醛、羥基丙酮醛、磷酸化羥基丙酮醛、乙二醛、苯甲酰乙二醛和許多其他的帶有烷基和芳香基團(tuán)的醛類都是它的底物[2]，具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證香蕉MaGLO14在非生物脅迫下的功能，我們通過(guò)將其轉(zhuǎn)化到酵母中進(jìn)行了驗(yàn)證，在鹽脅迫、水分脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫和紫外脅迫下都增強(qiáng)了酵母的存活率[16]。這些研究將對(duì)進(jìn)一步利用該基因進(jìn)行抗性育種具有重要意義。

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