張素軍

（臨沂大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000）

蒺藜（Tribulus terrestris L.）為蒺藜科 （Zygophyllaceae）一年生草本植物，分布于全國各地，其果實具有平肝解郁、活血祛風(fēng)、明目止癢等功效［1］。作為傳統(tǒng)中藥，蒺藜有著悠久的臨床應(yīng)用歷史，并且全國通用。我國地域廣袤，地理環(huán)境和氣候條件相差很大，不同產(chǎn)地的蒺藜在發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)上是否具有地域差異性以及道地性，這方面的研究將為蒺藜資源的合理利用和臨床用藥提供理論指導(dǎo)。本文應(yīng)用中藥指紋圖譜技術(shù)中的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜，對不同產(chǎn)地蒺藜的化學(xué)成分進行模糊聚類，以比較不同產(chǎn)地蒺藜在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)上的差異程度。

1 實驗材料

蒺藜果實2009年8月中旬分別采自山東、河北、新疆、黑龍江、云南和福建，分別以SD、HB、XJ、HLJ、YN、FJ表示，經(jīng)臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副教授王文房鑒定，均為Tribulus terrestris L.的果實。取此果實，75%乙醇消毒3min、蒸餾水充分沖洗后，于55℃烘箱中烘干，機械粉碎后過45目篩，置干燥器內(nèi)備用。所用試劑除特別說明外均為分析純，水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液的制備

分別精密稱取蒺藜果實粉末5.0g，置具塞三角瓶中，加蒸餾水50mL，稱重，室溫放置30min后，100℃水浴中提取60min，稱重，用蒸餾水補足減失重量，過濾，4000r·min－1離心10min，上清用0.4μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2 色譜條件

KR 006C18色譜柱（250mm ×4.6mm ，5μm）；甲醇（A）－0.1%醋酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫如表1所示；柱溫為 30℃；流速為0.5mL·min－1；檢測波長為254nm；進樣體積為10μL。所得色譜圖以山東樣品為例，見圖1。6個樣品的色譜峰以相對保留值進行排列。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗

按“2.1”項下制備山東樣品溶液，連續(xù)進樣5次，各共有色譜峰的相對峰面積的RSD均小于3%，表明本方法具有較高的精密度。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

按“2.1”項下制備山東樣品溶液，分別于0h、4h、8h、12h和24h進樣分析，各共有色譜峰的RSD均小于3%，表明樣品至少在24h內(nèi)是穩(wěn)定的。

圖1 山東蒺藜果實的HLC色譜

2.3.3 重現(xiàn)性試驗

取山東樣品5份，按“2.1”項下制備樣品溶液，每份樣品進樣1次，各共有色譜峰的相對峰面積的RSD均小于3%，表明本方法重現(xiàn)性較好。

表1 HPLC流動相變化梯度

2.4 模糊聚類分析

2.4.1 原始數(shù)據(jù)的采集和處理

按“2.2”項獲取六個產(chǎn)地蒺藜果實的HPLC色譜圖，如圖1所示（以山東果實為例），選取保留時間為22.3min左右的共有色譜峰為內(nèi)參照峰，求出樣品中所有峰的相對保留值α（α＝各組分峰的保留時間／內(nèi)參照峰的保留時間）和相對峰面積RA＝某個峰的面積／內(nèi)參照峰面積，在相對保留值1%的范圍內(nèi)進行共有峰排列，非共有峰的面積則以0記，如表2所示。以相對峰面積作為聚類指標。

2.4.2 模糊相似矩陣的建立

利用相關(guān)系數(shù)法對表5中的數(shù)據(jù)按公式

2.4.3 模糊等價矩陣的建立

根據(jù)平方法R→R2→R4→… 求模糊相似矩陣的傳遞閉包，即等價矩陣。由于R8＝R4，故R4為等價矩陣。

2.4.4 動態(tài)聚類

在0～1的范圍內(nèi)選取不同的置信水平λ值，求出等價矩陣的λ－截矩陣，從而在不同的λ水平上對對象進行模糊動態(tài)聚類，分類結(jié)果如下：

3 討論

模糊性是事物所具有的類屬和性態(tài)的不確定性，是反映事物本質(zhì)的極為深刻的屬性［2］。模糊聚類分析方法是對模糊性事物進行分類的方法，是對人腦模糊聚類的一種數(shù)學(xué)模寫。不同產(chǎn)地的同種植物在化學(xué)成分的種類和含量上沒有截然分明的界限，而是具有一定的模糊性，適于采用模糊聚類的方法進行分析［3，4］。同時，我們采用HPLC色譜法對蒺藜的水提物進行分析，得到的色譜峰的數(shù)目多，能夠基本上反映其物質(zhì)基礎(chǔ)的整體面貌。在此基礎(chǔ)上運用相關(guān)系數(shù)法對色譜峰進行模糊相聚類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0.999的置信水平上，六個產(chǎn)地的蒺藜聚為同一類，這是一個近乎為1.000的置信水平，這充分說明六個產(chǎn)地的蒺藜在化學(xué)成分上的種類和含量上可以說是沒有差異的。盡管我們的樣品數(shù)目較少，但由于地域跨度大，我們有理由相信，國內(nèi)不同地區(qū)的蒺藜在藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)上基本上沒有差異，這或許可以作為其可以通用而一直沒有提出道地性的一個佐證。當然，我們的樣品采集時間基本相同，不同采收期的蒺藜其化學(xué)成分是否有差異以及差異如何，需做進一步研究。

表2 不同產(chǎn)地蒺藜果實HPLC相對峰面積

［1］肖培根.新編中藥志［M］.第2卷.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：613－618.

［2］楊綸標，高英儀.模糊數(shù)學(xué)原理及應(yīng)用［M］.廣州：華南理工大學(xué)出版社，2002.

［3］趙蔡斌，周魯，付超，等.中藥復(fù)方的模糊分析［M］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2003，9（2）：62－63.

［4］謝春英，賀巍，林敬明，等.中藥黃芩及其混偽品的模糊聚類分析［J］.廣東微量元素科學(xué)，2000，7（12）：52－55.