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      甜菜EST-SSR引物的開發(fā)與應(yīng)用

      2011-07-26 13:52:46史樹德張子義邵金旺田自華
      中國糖料 2011年3期
      關(guān)鍵詞:甜菜核苷酸多態(tài)性

      史樹德,魏 磊,張子義,邵金旺,田自華

      (1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,呼和浩特 010019;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院,呼和浩特 010018;3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)甜菜生理研究所,呼和浩特 010018)

      甜菜是我國主要經(jīng)濟(jì)作物之一,其不僅是主要的制糖工業(yè)原料,也是發(fā)展畜牧業(yè)的優(yōu)良飼料,更是新興的能源作物,在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和發(fā)展地方經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。但由于中國不是甜菜起源國,缺少種質(zhì)資源,再加之相關(guān)研究積淀較薄,使我國的甜菜研究水平整體落后,甜菜育種水平落后于發(fā)達(dá)國家。而隨著基因組學(xué)研究的飛速發(fā)展,分子設(shè)計育種成為作物遺傳改良的重要途徑之一,新的分子標(biāo)記不斷被開發(fā)和廣泛應(yīng)用,從而加速了作物基因組輔助育種和設(shè)計育種的進(jìn)程[1]。近幾年,國內(nèi)外在甜菜分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究正在興起,但可利用分子標(biāo)記的匱乏嚴(yán)重制約其發(fā)展。目前,在甜菜基因組輔助育種研究中應(yīng)用到的分子標(biāo)記十分有限,僅有關(guān)于 RAPD[2-6]、AFLP 和 SNP[7]以及少數(shù) SSR[8-11]、ISSR[12]標(biāo)記的初步報道,其中可利用的甜菜SSR標(biāo)記很少。

      簡單序列重復(fù)(simple sequence repeats,SSRs)或微衛(wèi)星(microsatellites)是以 1~6個堿基為基元的串聯(lián)重復(fù)序列,它們普遍存在和均勻分布于大多數(shù)真核生物的基因組中,重復(fù)數(shù)高度變異[13-15]。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、容易用PCR檢測、重復(fù)性高等特點(diǎn),作為理想的分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用到許多植物的遺傳學(xué)研究中[16-18]。SSR標(biāo)記的開發(fā)有幾種[19-22]。EST-SSR是近年發(fā)展起來的新型分子標(biāo)記,作為表達(dá)基因部分序列的EST和cDNA數(shù)據(jù)近年來高速增加。截至2011年3月1日,GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)中的甜菜EST數(shù)據(jù)已有29830條。EST-SSR反映了基因的編碼部分,可以直接獲得基因表達(dá)的信息,為功能基因提供“絕對”的標(biāo)記,使得有可能對決定重要表型或農(nóng)藝性狀的等位基因進(jìn)行直接鑒定,省去了SSR引物開發(fā)過程中的克隆和測序步驟,充分利用了現(xiàn)有測序數(shù)據(jù),降低了開發(fā)成本,EST-SSR的開發(fā)在多種作物中已有報道[23-27]。

      為此,本研究目的是利用GenBank中已有的EST序列,開發(fā)基于EST序列的SSR標(biāo)記,并用其進(jìn)行甜菜種質(zhì)資源的遺傳多樣性驗(yàn)證,以篩選多態(tài)性高、重復(fù)性好的EST-SSR標(biāo)記;評價收集的甜菜種質(zhì)資源遺傳多樣性,為建立甜菜高密度遺傳圖譜、功能性分子標(biāo)記發(fā)掘、重要農(nóng)藝性狀QTLs克隆等研究奠定基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 供試材料

      本試驗(yàn)所用甜菜品種為甜研309和KWS9412,KWS9419,KWS5416,農(nóng)大甜研4號和包育302,種植于溫室,采用CTAB法[28]提取甜菜苗期新鮮葉片基因組DNA。

      1.2 EST-SSR的引物開發(fā)

      首先計算機(jī)安裝PC版perl程序,然后從GenBank/dbEST(http://www.ncbi.nlm.nih/entrez)中以FASTA格式下載sugar beet和Beta vulgaris L.中所有的EST序列,共29830條。 利用Blastclust(v.2.2.10;http://www.ncbi.nih.gov/web/newsltr/spring04/blastlab.htm)軟件,對這些EST序列進(jìn)行冗余性查找,利用CD_HIT(http://www.bioinformatics.org/cd-hit/)快速批量去冗余序列;利用 est_timmer(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)去除EST 序列中過短的序列(<100bp)和過長的序列(>700bp)以及 mRNA 的“帽子”和“尾巴”,利用 misa.pl(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)識別和定位SSR,其中配置文件misa.ini用來設(shè)置識別SSR標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn);利用primer3模塊批量設(shè)計SSR引物,引物設(shè)計的主要參數(shù)是,引物長度20~26bp;退火溫度Tm值48℃~65℃;(G+C)含量30%~70%;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度大于150bp;利用MacVector7.0軟件對所設(shè)計的引物進(jìn)行驗(yàn)證,引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

      1.3 EST-SSR的擴(kuò)增與檢測

      PCR反應(yīng)在25μL的體積中進(jìn)行,含PCR緩沖液、50~80 ng的模板DNA、1.5 U Taq聚合酶,上、下游引物各0.5μmol/L、200μmol/L dNTP和2.0 mmol/L MgCl2。整個反應(yīng)過程在PE 9700上進(jìn)行,循環(huán)條件是:94℃預(yù)變性3min;然后35個循環(huán),每個循環(huán)包括94℃變性45s,復(fù)性的合適溫度通過溫度梯度實(shí)驗(yàn)確定,并盡可能提高復(fù)性溫度以增加特異性,復(fù)性時間60s,72℃延伸1min 20s;最后于72℃延伸8min。復(fù)性溫度低于50℃仍無產(chǎn)物出現(xiàn),則認(rèn)為該引物不能擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

      1.4 多態(tài)信息含量和遺傳相似系數(shù)分析

      多態(tài)信息含量常被用來評估所設(shè)計引物的潛在利用率。本實(shí)驗(yàn)的每個EST-SSR引物的多態(tài)信息含量按Park等[29]提供的公式計算,即其中Pi為i位點(diǎn)的基因頻率,n為等位基因數(shù)。遺傳相似系數(shù)分析利用NTSYS-pc軟件[30]的SIMQUAL模塊計算6個甜菜品種間的遺傳相似系數(shù)。然后基于遺傳相似系數(shù)矩陣,依據(jù)UPGMA算法并利用NTSYS-pc軟件的SHAN聚類程序?qū)?個材料進(jìn)行聚類分析。

      2 結(jié)果和分析

      2.1 甜菜EST-SSR的特征

      從NCBI網(wǎng)站下載的29830條主要來源于sugar beet和Beta vulgaris L.的EST序列(截止2011年3月1日)。經(jīng)過除去ploy A或T“尾巴”和載體等序列后共獲得20109條無冗余EST序列,序列總長度為11287687bp。按照上述查找標(biāo)準(zhǔn),共發(fā)現(xiàn)6951條至少含有1個SSR的EST序列,占無冗余EST總數(shù)的34.6%,表明甜菜EST-SSR含量比較豐富。按照SSR具體實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計要求,從4338個SSR重復(fù)中設(shè)計得到2845對EST-SSR引物。這些引物對中有1052個含有1個SSR重復(fù),其余1793對含有2個或2個以上的SSR重復(fù)。在鑒定的SSR中A/T單堿基重復(fù)最多,其最少重復(fù)9次,最大重復(fù)28次;AAG/CTT三核苷酸重復(fù)次之,最少重復(fù)5次;AG/CT二核苷酸重復(fù)居第三,最少重復(fù)6次;四、五和六核苷酸重復(fù)數(shù)量最少,其最少重復(fù)5次(見表1);在同一條EST序列中所含2個SSR位點(diǎn)之間最小相距2個核苷酸,最大相距100個核苷酸。其中除單核苷酸重復(fù)外,AAG/CTT三核苷酸重復(fù)基元是出現(xiàn)頻率最高的EST-SSR類型,占總SSR的12.7%,AG/CT次之,占10.4%,ACCTCC/AGGTGG等六核苷酸重復(fù)最少,約占1%。

      表1 在20109條甜菜EST序列中發(fā)掘的不同基元的SSR數(shù)量及百分率統(tǒng)計

      2.2 EST-SSR引物的擴(kuò)增效率

      在所得的2845對SSR引物中隨機(jī)挑選并合成了100個SSR引物對,在前述給定的條件下對6個品種甜菜基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,有47對(47%)引物擴(kuò)增出了SSR特征條帶,共產(chǎn)生621個位點(diǎn),平均每對引物產(chǎn)生13.2個位點(diǎn)。表2為47個具有功能性引物對的相關(guān)信息。在47個功能性引物對中,有14個引物對(29.7%)擴(kuò)增出1條產(chǎn)物帶,有25個引物對(31.9%)擴(kuò)增出2條條帶,8個引物對(17.2%)擴(kuò)增出2條以上條帶;有38個引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物在預(yù)期片段大小范圍之內(nèi),占功能性引物對的80.8%,9個引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物小于預(yù)期片段大??;此外,在33個擴(kuò)增出2條或2條以上條帶的引物對中,有9個引物對擴(kuò)增出比預(yù)期片段大的條帶,在47個功能性引物對中,有25個引物對在6個甜菜品種間擴(kuò)增出多態(tài)性,多態(tài)性引物對占53.2%。25個引物對在6個品種中共擴(kuò)增出138個多態(tài)性標(biāo)記。

      2.3 EST-SSR引物的多態(tài)性分析

      每對引物的多態(tài)性信息含量用PIC值表示,并用量估計等位基因的變異情況。依據(jù)47對引物在6個甜菜品種中擴(kuò)增得到的等位基因的變異信息來計算各引物的PIC值。它們的PIC值變化在0.13~0.71之間,平均為0.47,引物S9的PIC值最大,達(dá)0.71;而引物S10的最小,只有0.13。

      2.4 遺傳相似系數(shù)分析

      基于這 25個多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記,依據(jù)UPGMA算法利用NTSYS-pc2.1軟件將本研究所用6個甜菜品種進(jìn)行聚類分析,可將6個品種劃分為不同的兩組(圖1):第一組為國內(nèi)品種,其中甜研309與農(nóng)大甜研4號和包育302親緣關(guān)系較遠(yuǎn),第二組為親緣關(guān)系較近的德國KWS系列3個品種,系統(tǒng)發(fā)育分析表明國內(nèi)外兩組材料親緣關(guān)系較遠(yuǎn),遺傳相似度較低,相似系數(shù)為0.31。

      表2 甜菜ESTs中分離到的部分微衛(wèi)星引物

      3 討論

      與其他分子標(biāo)記相比,EST-SSR標(biāo)記來自表達(dá)基因的全部或部分序列,其多態(tài)性可能直接與該基因功能相聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn),水稻的蠟質(zhì)基因5'端非編碼區(qū)中的SSR序列(CT)n長度變化不僅與直鏈淀粉的含量有關(guān)[31],而且還決定了糯稻淀粉的理化特性[32]。因此根據(jù)EST包含的SSR位點(diǎn)開發(fā)的分子標(biāo)記,是直接與功能相關(guān)的功能標(biāo)記[33],EST-SSR標(biāo)記的這一特點(diǎn)決定了其在功能基因標(biāo)記方面應(yīng)用前景廣闊。

      本研究中,多態(tài)信息位點(diǎn)PIC值變化在0.13~0.71之間,較已知甜菜SSR標(biāo)記PIC值低[34],可能是由于EST標(biāo)記來源于基因編碼區(qū),具有很高的保守性,因此它們在品種之間的多態(tài)性要低于來源其它基因組區(qū)域分子標(biāo)記[35],但是通過根據(jù)EST 5'端或3'端的UTR區(qū)開發(fā)的SSR標(biāo)記多態(tài)性要稍好些[33]。因此,在設(shè)計引物時,可設(shè)定軟件條件,應(yīng)盡量使引物靠近3'或5'端非編翻譯區(qū)。本研究中較低的PIC值與張艷欣和Taliercio等人的研究結(jié)果一致[36,18],表明基于表達(dá)基因的EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性確實(shí)低于基因組SSR[37]。在100對引物中有47對成功擴(kuò)增出了SSR特征條帶,其它未獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的引物可能的原因是正向引物或反向引物或二者都恰好跨過了mRNA的剪切位點(diǎn),也可能是由于在相應(yīng)的基因組DNA中存在較大的內(nèi)含子,這兩個原因都會導(dǎo)致引物無法與模板DNA結(jié)合而不能擴(kuò)增,從而導(dǎo)致擴(kuò)增效率較低。基于遺傳相似系數(shù)的聚類分析表明,國內(nèi)和國外品種間遺傳差異度較大,可能是其親本來源不同所致。本研究中,三核苷酸重復(fù)數(shù)量高于二核苷酸重復(fù),此結(jié)果與EST中三核苷酸比二核苷酸更為豐富的結(jié)論相符[32]。

      綜上,EST-SSR標(biāo)記易于開發(fā)、成本較低,其功能可以通過序列同源性比對獲得。而且由于來自于轉(zhuǎn)錄譜,能夠反映出轉(zhuǎn)錄區(qū)的差異,使得EST-SSR標(biāo)記在遺傳多樣性分析、比較作圖和分子標(biāo)記輔助選擇育種的研究中具有更高的應(yīng)用價值。

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