張 輝 ，王華忠 ，2，3

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080；2.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱 150080；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

甜菜是我國(guó)主要的糖料作物之一，長(zhǎng)期以來通過常規(guī)育種在產(chǎn)量、質(zhì)量及抗病性方面并沒有取得突破性的進(jìn)展。航天誘變育種是近些年來新發(fā)展起來的一種新的誘變育種方法，大大提高了作物突變的頻率，使作物在形態(tài)特征、經(jīng)濟(jì)性狀、生育性狀方面發(fā)生較大變異。劉華君、王燕飛等（1996）研究發(fā)現(xiàn)不同倍性的甜菜種子通過衛(wèi)星搭載誘變處理后，會(huì)表現(xiàn)出不同的敏感性，與對(duì)照相比，四倍體材料部分性狀在生長(zhǎng)過程中受到抑制，生育期延遲，對(duì)二倍體材料的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，生長(zhǎng)勢(shì)增強(qiáng)，初步說明外層空間環(huán)境不僅影響植物的生理狀態(tài)，也影響植物的遺傳基因[1]。王華忠等對(duì)8個(gè)甜菜航天育種材料及其對(duì)照進(jìn)行田間觀察及葉綠素含量分析，研究結(jié)果表明一年生航天材料與對(duì)照比較，在整個(gè)期間葉綠素含量均表現(xiàn)出較高的趨勢(shì)，說明對(duì)于增強(qiáng)光合作用，提高生物產(chǎn)量具有較好的效果。二年生材料在葉叢生長(zhǎng)期表現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩，有的少數(shù)植株葉片變窄，個(gè)別生長(zhǎng)畸形，而到了抽薹期，則表現(xiàn)為抽薹率低[2]。劉乃新等以航天誘變的3個(gè)不同甜菜品系及其對(duì)照為材料，對(duì)生殖生長(zhǎng)階段的甜菜葉片的4種激素（IAA、GA、ABA和ZR）含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明航天誘變材料發(fā)生了很大的變化[3]。但對(duì)于甜菜航天誘變材料同工酶譜分析方面還未有相關(guān)報(bào)道。同工酶一詞是Markert和Moller于1957年提出來的[4]，可用于研究物種進(jìn)化、遺傳變異、雜交育種和個(gè)體發(fā)育、組織分化等，同工酶能在一定程度上反映蛋白質(zhì)水平上的信息[5-7]，植物體內(nèi)不同酶的同工酶譜隨著細(xì)胞分化、組織器官及植株的生長(zhǎng)、成熟發(fā)生規(guī)律性的變化，這種變化在一定程度上反映了植物在發(fā)育過程中基因表達(dá)的時(shí)空順序性，因而同工酶的酶譜特征可以作為植物生長(zhǎng)發(fā)育和遺傳轉(zhuǎn)化的一種生理生化指標(biāo)[8-9]。該試驗(yàn)利用同工酶酶譜分析的方法研究航天誘變后的SP3代材料在生理生化水平上的變異，旨在為下一步探討分子水平的變異性及研究變異對(duì)甜菜田間性狀的影響提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為搭載我國(guó)第一顆航天育種衛(wèi)星“實(shí)踐八號(hào)”的甜研202、甜研207、甜研212、甜研425、甜研單粒-86的SP3代衍生材料及其對(duì)照。其中甜研202、甜研207、甜研212為二倍體材料；甜研425為四倍體材料；甜研單粒-86為單粒種材料。試驗(yàn)用甜菜二年生材料母根栽植時(shí)期為2010年4月27日，于2010年6月20日、7月14日取樣，分別為甜菜的盛花期、抽薹期。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶液提取 取預(yù)處理的甜菜葉片1.0g放入預(yù)冷的研缽中，加入預(yù)冷的1.5mL 0.02mol/L KH2PO4和0.1g PVP（聚乙烯吡咯烷酮），快速研磨成勻漿后，于離心機(jī)上5000r/min 4℃離心15min，取上清液加入等體積的10%甘油混勻，放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 電泳 該試驗(yàn)采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為2.4%。

1.2.3 染色 POD同工酶染色利用聯(lián)苯胺染色[10]；EST同工酶染色采用醋酸萘酯-堅(jiān)牢藍(lán)染色法[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜航天誘變SP3代二年生材料盛花期同工酶譜分析

2.1.1 二年生材料盛花期POD同工酶譜分析 為了研究方便，按同工酶譜帶遷移率和顏色的不同分別將POD、EST酶譜分為A、B、C三個(gè)區(qū)域。表1為SP3代二年生育種材料各品系與盛花期POD、EST電泳圖譜中序號(hào)對(duì)應(yīng)表格。由SP3代二年生育種材料盛花期POD同工酶電泳（圖1）可知，該圖譜中總條帶數(shù)為8條酶帶，四倍體衍生材料HT2-425-1和HT2-425-2條帶間無差異性，二者較對(duì)照在B區(qū)多出兩條帶；單粒種衍生材料HT8-86較對(duì)照在A區(qū)多出1條帶；二倍體衍生材料不同品系：HT6-212-2較對(duì)照在B區(qū)多出1條酶帶，HT6-212-1、HT6-212-4較對(duì)照分別在A、B區(qū)域各多出1條酶帶，但二者在B區(qū)多出的條帶位置不一致。HT6-212-3與對(duì)照相比在A區(qū)多出 1 條 帶。 HT5-207、HT5-207-1、HT5-207-2-1、HT5-207-2-5較對(duì)照均在B區(qū)多出兩條帶，但HT5-207較對(duì)照在C區(qū)缺失1條帶。HT5-207-2-3、HT5-207-3、HT5-207-2-4、較對(duì)照在B區(qū)多出 1條帶，HT4-202較對(duì)照在各區(qū)均多出1條帶。

2.1.2 二年生材料盛花期EST同工酶譜分析 由SP3代二年生育種材料盛花期EST同工酶電泳 （圖2）可知，該電泳酶譜總條帶數(shù)為8條。單粒品系HT8-86較對(duì)照在B區(qū)缺失1條酶帶；四倍體品系HT2-425-1、HT2-425-2較對(duì)照無條帶差異性；二倍體品系中：HT6-212-4、HT6-212-1較對(duì)照條帶無差異性，而HT6-212-3、HT6-212-2較對(duì)照分別在C區(qū)多出1條酶帶，在B區(qū)少了1條酶帶。HT4-202較對(duì)照在B區(qū)多出 1 條酶帶。HT5-207、HT5-207-2-1、HT5-207-1、HT5-207-2-4較對(duì)照分別在B區(qū)多出1條酶帶，HT5-207-2-2、HT5-207-2-3較對(duì)照無差異性，HT5-207-3較對(duì)照在C區(qū)缺失1條帶，HT5-207-2-5較對(duì)照在B、C區(qū)各缺失1條酶帶。

2.2 甜菜航天誘變SP3代二年生材料抽薹期同工酶譜分析

2.2.1 二年生材料抽薹期POD同工酶譜分析 表2為SP3代二年生育種材料各品系與抽薹期POD、EST電泳圖譜中序號(hào)對(duì)應(yīng)表格，圖3為二年生材料抽薹期POD同工酶譜。由該圖譜分析可知，該電泳圖譜總條帶數(shù)為8條。單粒種材料HT8-86較對(duì)照在B區(qū)多出1條酶帶；多倍體材料HT2-425-1、HT2-425-2較對(duì)照分別在B、C區(qū)缺失了1條帶，且各個(gè)條帶區(qū)域顏色均要淺于對(duì)照；二倍體品系材料中：HT6-212-1與HT6-212-2帶型一致，較對(duì)照分別在B、C區(qū)多出1條帶。HT6-212-4較對(duì)照均在B區(qū)多出1條酶帶，且各區(qū)酶帶的顏色均要深于對(duì)照。而HT6-212-3同對(duì)照相比在B區(qū)缺失1條帶，而在C區(qū)多出1條帶。HT5-207-1、HT5-207-2-4、HT5-207-2-5、HT5-207-2-3、HT5-207-2-2較對(duì)照分別在B、C區(qū)多出1條帶。HT5-207-2-1較對(duì)照在B區(qū)缺失了1條帶,而在C區(qū)多出1條酶帶，HT5-207較對(duì)照在B區(qū)缺失了1條酶帶。HT5-207-3較對(duì)照無條帶差異性。HT4-202-3較對(duì)照無條帶差異性。HT4-202較對(duì)照分別在B、C缺失1條帶。

表1 盛花期POD、EST電泳圖譜中各品系對(duì)應(yīng)序號(hào)

圖1 SP3代二年生育種材料盛花期POD同工酶圖譜（上端為正極，下端為負(fù)極）

圖2 SP3代二年生育種材料盛花期EST同工酶圖譜（上端為正極，下端為負(fù)極）

表2 抽薹期POD、EST電泳圖譜中各品系對(duì)應(yīng)序號(hào)

圖3 SP3代二年生育種材料抽薹期POD同工酶圖譜（上端為正極，下端為負(fù)極）

2.2.2 二年生材料抽薹期EST同工酶譜分析 由SP3代二年生材料抽薹期EST同工酶圖譜 （圖4）分析可知，該電泳圖譜總條帶數(shù)為9條。單粒種材料HT8-86較對(duì)照在B區(qū)缺失1條酶帶；四倍體材料HT2-425-1、HT2-425-2較對(duì)照帶間無差異性；二倍體材料中HT6-212-3、HT6-212-4較對(duì)照條帶間無差異性，HT6-212-2較對(duì)照在B區(qū)缺失了1條帶，HT6-212-1較對(duì)照分別在B、C區(qū)多出1條酶帶。HT4-202較對(duì)照在B區(qū)多出兩條酶帶，HT4-202-3較對(duì)照在B區(qū)多出1條酶帶，HT5-207-1、HT5-207-2-4、HT5-207-2-1、HT5-207、HT5-207-2-2較對(duì)照在B區(qū)多出1條酶帶，但HT5-207-1、HT5-207-2-2、HT5-207-2-1與HT5-207-2-4、HT5-207在B區(qū)多出的條帶位置不同，其中HT5-207較對(duì)照在A區(qū)缺失了1條帶。HT5-207-3較對(duì)照在C區(qū)缺失1條帶。HT5-207-2-5、HT5-207-2-3較對(duì)照條帶間無差異性。

圖4 SP3代二年生育種材料抽薹期EST同工酶圖譜（上端為正極，下端為負(fù)極）

3 討論與結(jié)論

同工酶在一定程度上能反映蛋白質(zhì)水平上的信息，植物體內(nèi)不同酶的同工酶譜隨著細(xì)胞分化、組織器官及植株的生長(zhǎng)、成熟發(fā)生規(guī)律性的變化，這種變化在一定程度上反映了植物在發(fā)育過程中基因表達(dá)的時(shí)空順序性，因而同工酶的酶譜特征可以作為植物生長(zhǎng)發(fā)育和遺傳轉(zhuǎn)化的一種生理生化指標(biāo)。該試驗(yàn)以SP3代衍生育種材料及其對(duì)照為試驗(yàn)材料，對(duì)不同倍性材料各品系進(jìn)行了同工酶酶譜的差異性研究分析，結(jié)果表明：（1）甜菜航天誘變SP3代二年生材料在盛花期、抽薹期的EST、POD同工酶譜分析中，各個(gè)品系材料間表現(xiàn)出一定的差異性，航天誘變材料較對(duì)照條帶數(shù)基本呈增多趨勢(shì)，且酶活性高于對(duì)照；（2）兩個(gè)時(shí)期的同工酶譜圖相比較分析表明，EST、POD同工酶譜在這兩個(gè)時(shí)期總條帶數(shù)基本沒有太大變化；（3）航天誘變后不同倍性材料之間，二倍體材料變異率明顯高于四倍體材料、單粒種材料。導(dǎo)致出現(xiàn)以上結(jié)果的原因可能是太空輻射誘變是一個(gè)很復(fù)雜的過程，射線的能量沉積在物質(zhì)上，引起物質(zhì)的原子和分子的激發(fā)與電離，電離過程可以形成自由基，自由基與DNA相互作用可以引起DNA多種類型的損傷，包括堿基變化、脫落、氫鍵的斷裂、單雙鍵的斷裂、DNA及蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子之間的交聯(lián)[12－13]，從而導(dǎo)致航天誘變后材料在同工酶水平發(fā)生變化。航天過程的條件極為復(fù)雜，能夠使植物遺傳性發(fā)生變異常常是以微重力和強(qiáng)輻射為主要因素的多因素的綜合效應(yīng)。該試驗(yàn)研究結(jié)果表明誘變后SP3代衍生材料較對(duì)照在生理生化水平上表現(xiàn)出一定的差異性，說明在空間復(fù)雜的環(huán)境條件下，不同個(gè)體變異是多樣的。但該變異在甜菜育種工作的具體應(yīng)用有待于進(jìn)一步研究確定。

[1]劉華君，王燕飛，于伯成，等.甜菜種子衛(wèi)星搭載誘變效應(yīng)分析[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000（5）：203－204.

[2]王華忠，吳則東，韓英，等.甜菜航天育種材料的葉綠素含量及某些形態(tài)特征研究初報(bào)[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（4）:1134-1141.

[3]劉乃新，吳則東，王華忠.航天誘變對(duì)甜菜生殖生長(zhǎng)期幾種激素含量的影響[J].中國(guó)糖料，2010（2）：20-22.

[4]Markert C L,Miller F.Multiple forms of enzymes:tissue,ontogenetic,and species specific patterns[J].Proc.Nat.Acad.Sci.,1959,45:753-763.

[5]賴德CC，泰勒CB//范培昌譯.同工酶[M].北京：科學(xué)技術(shù)出版社，1987.

[6]雷濘菲，蘇智先，陳勁松.同工酶技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用[J].四川師范學(xué)院學(xué)報(bào)//自然科學(xué)版，2000，21（4）：321-324.

[7]程家勝.同工酶分析在果樹種質(zhì)資源分類遺傳研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)果樹，1986（3）：19-22.

[8]Tacchini P,Fink A,Xue G.Xing,GasparT.Analysis of proteins of a fully habituated nonorganogenic sugarbeet callus and a hormone-dependent one by high-performance 2-D gel electrophoresis[J].Plant Physiol Biochem.,1995,33:361-366.

[9]Sandra Aparecida de Oliveira Collet,Marcos Andre'Collet,Maria de Fa'timaP.S.Machado.Differential gene expression for isozymes in somatic mutants of Vitis vinifera L.（Vitaceae）[J].Biochemical Systematics and Ecology,2005,33:691-703.

[10]Rasol Marijana Krsnik,Cipcic Hana,Hagege Daniel.Isoesterases related to cell differentiation in plant tissue culture[J].Chemico-Biological Interactions,1999,119／120:587-592.

[11]汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2000：77.

[12]鐘波，朱列書，賀鵬，等.淺談航天誘變育種[J].作物研究，2007,21（5）:511-516.

[13]王乃彥.開展航天育種的科學(xué)研究工作，為我國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展做貢獻(xiàn)[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2002,16（5）:257-260.