鳥苷對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)的舒張作用及機(jī)制

王 勛，羅珊珊，蔣嘉燁，陸家鳳，可 燕

(上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203)

鳥苷(guanosine)屬嘌呤核苷一類成分，廣泛存在于半夏、板藍(lán)根、黃芪、當(dāng)歸等藥用植物之中。核苷類成分作為抗病毒和抗代謝藥物已被廣泛報(bào)道和應(yīng)用［1－2］，但尚未見對(duì)其中鳥苷的研究報(bào)道。因此，為探索鳥苷的藥理作用，本實(shí)驗(yàn)在大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)灌流模型的基礎(chǔ)上通過觀察鳥苷對(duì)去除內(nèi)皮血管環(huán)的張力的影響，探討其對(duì)大鼠血管環(huán)的作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法:

1.1 設(shè)備 Powerlab八通道多功能生理記錄儀(AD Instruments公司)，Powerlab血管功能測(cè)定系統(tǒng)(AD Instruments公司)。

1.2 藥物與試劑 乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)、去氧腎上腺素(phenylephrine，PE)、毛喉素(forskolin，F(xiàn)SK)、葡萄糖(glucose)購(gòu)于 Sigma公司，左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)、亞甲藍(lán)(methylene blue)、吲哚美辛(indomethacin)購(gòu)于Adamas公司，鳥苷購(gòu)于上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化中心。KCl等無機(jī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Krebs-Henseleit(K-H)工作液(mmol·L－1:NaCl 118，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgCl21.2，NaHCO325，CaCl22.5，Glucose 11，pH=7.4)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，♂，體質(zhì)量(250±10)g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.4 血管環(huán)制備 迅速游離SD大鼠胸主動(dòng)脈，置于4℃，含95%O2和5%CO2混合氣體預(yù)飽和的K-H液中，剔除周圍結(jié)締組織，剪成3～4 mm的血管環(huán)。將血管環(huán)懸掛于預(yù)置5 ml K-H液的浴槽內(nèi)，37℃恒溫，持續(xù)通入95%O2和5%CO2的混合氣體。胸主動(dòng)脈每條血管給予2.0 g拉力，每20 min換液1次，平衡60 min。以60 mmol·L－1的 KCl預(yù)收縮兩次，以誘發(fā)血管的最大收縮幅度，待血管穩(wěn)定后，加入1 μmol·L－1濃度的 PE 收縮，待血管拉力達(dá)到坪值后，加入梯度濃度的 ACh(10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mol·L－1)，觀察血管的舒張情況來檢驗(yàn)內(nèi)皮完整性。觀察去內(nèi)皮血管環(huán)時(shí)，引起的舒張反應(yīng)小于20%則認(rèn)為內(nèi)皮失去功能。

1.5 大鼠胸主動(dòng)脈舒張功能測(cè)定 檢驗(yàn)內(nèi)皮完整性后，血管環(huán)用K-H液清洗3次，至其恢復(fù)基礎(chǔ)張力。然后以PE 1 μmol·L－1誘發(fā)最大收縮幅度，加入藥物后觀察藥物的舒張情況，以FSK 1 μmol·L－1舒張程度作為 100%的舒張［3］。

1.6 累積濃度的鳥苷對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)或KCl預(yù)收縮血管環(huán)的影響 以不同累積濃度的鳥苷直接作用于基礎(chǔ)狀態(tài)血管環(huán)或KCl(60 mmol·L－1)預(yù)收縮血管環(huán)，實(shí)驗(yàn)組(n=6)采用累積加藥法，每2min加鳥苷1 次，使灌流液中鳥苷終濃度分別達(dá) 10－9，10－8，10－7，10－6，10－5mol·L－1，觀察鳥苷對(duì)血管環(huán)的作用，對(duì)照組(n=6)以K-H液代替鳥苷累積加入。

1.7 累積濃度的鳥苷對(duì)PE預(yù)收縮的血管環(huán)的影響 以不同累積濃度的鳥苷作用于PE預(yù)收縮的血管環(huán)，實(shí)驗(yàn)組(n=6)以 10－4mol·L－1預(yù)收縮，采用累積加藥法，具體方法如“1.6”所述，觀察鳥苷作用;對(duì)照組(n=6)以K-H液替代鳥苷累積加入。

1.8 鳥苷對(duì)用L-NAME、亞甲藍(lán)和吲哚美辛預(yù)處理的內(nèi)皮完整的血管環(huán)PE誘導(dǎo)的收縮影響 分別以L-NAME、吲哚美辛和亞甲藍(lán)(0.1 mmol·L－1)孵育內(nèi)皮完整血管環(huán)20 min后，以PE預(yù)收縮，觀察累積濃度鳥苷的血管舒張作用;對(duì)照組(n=6)以K-H液替代鳥苷累積加入。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 11.0軟件分析，以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 累積濃度的鳥苷對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)和KCl預(yù)收縮血管環(huán)的作用 在基礎(chǔ)狀態(tài)下和KCl預(yù)收縮狀態(tài)下，各累積濃度鳥苷對(duì)具內(nèi)皮和去內(nèi)皮血管環(huán)均無明顯作用(P＞0.05)。見Fig 1。

Fig 1 Effect of guanosine on vasomotor function of intact endothelium or endothelium-denuded aortic rings in basal tension(A)and precontracted by KCl(B).

2.2 累積濃度的鳥苷對(duì)PE預(yù)收縮的血管環(huán)的作用 內(nèi)皮完整組中，給藥組與對(duì)照組相比，差異具有顯著性(P＜0.05)，給藥組具有30%以上的舒張率，說明鳥苷可舒張PE預(yù)收縮的大鼠血管環(huán)。去內(nèi)皮組中，各濃度的鳥苷不能使PE收縮的血管舒張，結(jié)果與對(duì)照組相比，差異無顯著性(P＞0.05)。

2.3 鳥苷對(duì)用L-NAME、亞甲藍(lán)和吲哚美辛預(yù)處理的內(nèi)皮完整的血管環(huán)PE誘導(dǎo)的收縮作用 吲哚美辛組中，對(duì)照組與給藥組相比差異無顯著性，而L-NAME組與亞甲藍(lán)組中，對(duì)照組與給藥組相比差異有顯著性。說明一氧化氮合酶抑制劑L-NAME或鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑亞甲藍(lán)預(yù)處理，對(duì)于鳥苷的血管舒張作用有明顯的抑制作用。

Fig 2 Effect of guanosine on vasomotor function of intact endothelium or endothelium-denuded aortic rings precontracted by phenylephrine PE(A)and after incubated with indomethacin or L-name or Methylene Blue(B)

3 討論

鳥苷廣泛存在于藥用植物中，并且作為藥物質(zhì)量控制的指標(biāo)成分被廣泛應(yīng)用［4－5］。本實(shí)驗(yàn)在觀察鳥苷對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈血管環(huán)(內(nèi)皮完整)的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)的血管環(huán)張力無影響，對(duì)KCl預(yù)收縮的血管環(huán)張力也無明顯作用，對(duì)PE預(yù)收縮的血管環(huán)具有舒張作用。

關(guān)于 PE和 KCl的舒張機(jī)制，已有研究表明［6－9］，雖然兩者都可通過增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度而引起血管收縮，但機(jī)制卻不同。KCl引起平滑肌細(xì)胞超極化而刺激血管收縮，其機(jī)制主要是開放細(xì)胞膜上的電壓門控型鈣通道，引起細(xì)胞外鈣內(nèi)流。而PE誘導(dǎo)的血管收縮是激活α1-腎上腺素受體的結(jié)果，主要是通過激活磷脂酶C，產(chǎn)生二酞甘油(diacylslyeerol，DAG)和三磷酸肌醇(1，4，5-triphosphateinositol，IP3)，DAG可以通過蛋白激酶 C(protein kinase，PKC)激活肌凝蛋白輕鏈，而IP3則可以誘導(dǎo)肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣離子釋放。本實(shí)驗(yàn)中鳥苷不能舒張KCl誘導(dǎo)的血管收縮，說明鳥苷的舒縮機(jī)制可能與電壓門控鈣通道無關(guān)，而可能與抑制血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)鈣釋放有關(guān)。血管環(huán)的舒張不僅可由阻斷Ca通道引發(fā)，亦可通過血管內(nèi)皮的血管舒張因子引發(fā)。

進(jìn)一步研究表明，一氧化氮合酶抑制劑 LNAME或鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑亞甲藍(lán)可明顯抑制鳥苷的舒張作用。內(nèi)皮依賴性的血管舒張主要是通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生 NO［10－11］，NO 為血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的強(qiáng)效血管舒張因子，NO在內(nèi)皮NOS的作用下由左旋精氨酸轉(zhuǎn)化而來，通過激活平滑肌細(xì)胞可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，增加環(huán)鳥苷酸含量而使血管平滑肌舒張［12］，因此推測(cè)NO-GC-cGMP途徑可能介導(dǎo)了鳥苷的內(nèi)皮依賴性舒血管。吲哚美辛是環(huán)氧化酶的非特異性抑制劑，而花生四烯酸在環(huán)氧化酶的作用下可形成前列環(huán)素等血管舒張因子［13］，以吲哚美辛孵育對(duì)內(nèi)皮依賴性的血管環(huán)無影響，說明其舒縮機(jī)制可能與前列環(huán)素的合成與釋放無關(guān)。

綜上，鳥苷對(duì)大鼠離體血管胸主動(dòng)脈的舒張作用可能是多種途徑共同作用的結(jié)果，一方面其內(nèi)皮依賴性舒張機(jī)制可能與NO-GC-cGMP途徑相關(guān)，同時(shí)可能與IP3誘導(dǎo)的內(nèi)鈣釋放相關(guān)，確切機(jī)制尚有待于我們進(jìn)一步研究。

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