納米金抑制Ang－2和RGS－5表達(dá)導(dǎo)致裸鼠肝癌血管正?；?

傅岳武，潘運(yùn)龍△，覃 莉，孫 立，劉英梅

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院普外科，2醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，3醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，廣東 廣州 510632;4中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510120)

腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴其新生血管，抗血管生成不僅抑制腫瘤血管生長(zhǎng)，而且在治療后特定時(shí)間窗內(nèi)，能修復(fù)異常腫瘤血管系統(tǒng)，使其血管正常化。此時(shí)血管網(wǎng)絡(luò)清晰、管徑均勻、血管無(wú)扭曲及紊亂，血管形態(tài)和功能趨于正常，腫瘤組織間液壓降低，氧供及血供改善，從而提高放療和化療的敏感性;但抗血管生成治療使腫瘤血管出現(xiàn)正?；臅r(shí)間窗短暫，且不同的抗血管生成藥物，其腫瘤血管正?；拇翱谄谝膊槐M相同，大多集中在5～8 d［1］。納米金是抗血管生成藥，有抗腫瘤血管生成作用［2］，但納米金有無(wú)影響腫瘤血管正?；墓δ軇t未見報(bào)道。血管生成素(angiopoietin，Ang)及G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白－5(regulator of G －protein signaling－5，RGS－5)均參與腫瘤組織的血管生成和血管成熟過程，其中Ang－1和Ang－2表達(dá)的相對(duì)平衡有維持血管穩(wěn)定性的作用［3］，RGS－5表達(dá)的缺失有利于腫瘤血管外壁周細(xì)胞表型的成熟。周細(xì)胞有覆蓋內(nèi)皮細(xì)胞、包繞血管腔的作用，在新生血管中，成熟的周細(xì)胞覆蓋是血管趨向正常化的標(biāo)志［4］，因此本實(shí)驗(yàn)選用富血管的裸鼠肝癌模型，經(jīng)納米金處理后，不同時(shí)間窗內(nèi)檢測(cè)Ang－1、Ang－2及RGS－5在腫瘤組織中的表達(dá)，同時(shí)觀察腫瘤血管壁周細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化，來(lái)探討納米金使腫瘤血管正常化的時(shí)間窗及可能的機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物和試劑

BALB/c裸小鼠(nu/nu)48只，6周齡，體重為15～17 g，SPF級(jí)，購(gòu)自暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。H22人肝癌細(xì)胞株購(gòu)自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞凍藏中心。鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化酶試劑盒，購(gòu)自晶美生物技術(shù)公司;DAB酶底物濕色試劑盒，購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司。Ang－1、Ang－2和RGS－5試劑盒均購(gòu)于Sigma，3種抗體工作濃度均為1∶80。納米金合成原料氯金酸、檸檬酸三鈉、重鉻酸鉀和硫酸均購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑廠。用氯金酸檸檬酸三鈉還原法制備納米金，并作改進(jìn)，具體方法見文獻(xiàn)［5］。

2 動(dòng)物模型建立及分組

6周齡BALB/c裸鼠48只，稱重后，分別從裸鼠右腋皮下注入H22細(xì)胞，1×106個(gè)(0.2 mL)。4 d后，腫瘤在皮下形成約3～4 mm大小結(jié)節(jié)，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組36只裸鼠，對(duì)照組12只裸鼠。實(shí)驗(yàn)組裸鼠從腫瘤周圍及瘤內(nèi)注入納米金溶液0.2 mL(濃度為500 nmol/L)，每天1次，連續(xù)給藥3 d、7 d及11 d后，以安死術(shù)分別處死裸鼠，每次12只。對(duì)照組:用生理鹽水替代納米金，處理方法同實(shí)驗(yàn)組。每天稱重并觀察腫瘤生長(zhǎng)情況及注射部位皮膚有無(wú)潰瘍及感染，處死動(dòng)物，留取部分新鮮腫瘤組織標(biāo)本作電鏡觀察，余組織用4%甲醛溶液固定以備作免疫組化染色。另選取大小、體重與實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組基本一致的6周齡BALB/c裸鼠2只設(shè)為陰性對(duì)照組。該組動(dòng)物正常飼養(yǎng)，無(wú)任何藥物注射，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后安死術(shù)處死。取部分正常新鮮肝組織作電鏡觀察，余下組織用4%甲醛溶液固定作免疫組化染色。

3 Ang－1、Ang－2、RGS－5及不成熟周細(xì)胞覆蓋率(immature pericyte coverage index，IMPI)檢測(cè)

所有標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定、常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋。4 μm厚連續(xù)切片，分別做HE和免疫組化染色。采用鏈酶親和素－生物素過氧化物酶(SP)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。Ang－1、Ang－2和RGS－5表達(dá)陽(yáng)性者在細(xì)胞膜和(或)胞質(zhì)見清晰棕黃色顆粒沉積為準(zhǔn)。在200倍鏡下，每例標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野觀察100個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)，顯色陽(yáng)性細(xì)胞(清晰棕黃色染色)占總細(xì)胞計(jì)數(shù)≥10%為陽(yáng)性;否則為陰性。對(duì)于陽(yáng)性率＜10%，不論其染色強(qiáng)度如何均為陰性。對(duì)照設(shè)置:陽(yáng)性對(duì)照分別選用抗體高表達(dá)的組織切片，以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。

IMPI定義為RGS－5陽(yáng)性表達(dá)的周細(xì)胞數(shù)目占總細(xì)胞數(shù)目的百分?jǐn)?shù)。IMPI計(jì)算以連續(xù)切片中，高倍視野下RGS－5陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%。記錄5個(gè)不同區(qū)域的數(shù)據(jù)，計(jì)算平均數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

4 電鏡觀察周細(xì)胞

取離體30 min內(nèi)的新鮮腫瘤組織，用含有飽和苦味酸的多聚甲醛液固定5 h。以0.1%PBS液漂洗標(biāo)本后，20%蔗糖沉淀。50 μm厚振蕩切片機(jī)切片，在24孔培養(yǎng)板內(nèi)備做免疫電鏡。電鏡操作步驟:免疫組化常規(guī)染色，并以DAB+氯化鈷加強(qiáng)發(fā)色;蒸餾水終止發(fā)色，并反復(fù)漂洗;鋨酸染色1 h，而后0.1%PBS漂洗;置于50%乙醇和醋酸雙氧鈾混合物內(nèi)1 h;70%、80%、95%、100%乙醇梯度漂洗;浸入環(huán)氧丙烷、環(huán)氧丙烷和樹膠(4∶1、2∶1和1∶1)混合物各1 h，而后包埋。在H－600型透射電鏡下觀察拍片。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料樣本率之間的比較采用卡方檢驗(yàn)或確切概率(Fisher's exact)法。

結(jié) 果

1 納米金對(duì)Ang－1和Ang－2表達(dá)的影響

Ang－1主要表達(dá)于細(xì)胞核中，呈棕褐色，見圖1;Ang－2主要表達(dá)于胞漿中，呈金黃色，見圖2。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組裸鼠在第7 d時(shí)Ang－1陽(yáng)性率最高，Ang－2陽(yáng)性率最低，與對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組第3 d、第11 d時(shí)陽(yáng)性率比較，均有顯著差異(P＜0.01或P＜0.05)，見表 1。

Figure 1.Expression of Ang－1 in the H22 hepatic tumor with nanogold treatment(immunohistochemical staining，×200).A:3 d nanogold treatment group;B:7 d nanogold treatment group;C:11 d nanogold treatment group;D:control group.圖1 納米金作用下不同時(shí)間窗內(nèi)Ang－1的表達(dá)情況

Figure 2.Expression of Ang－2 in the H22 hepatic tumor with nanogold treatment(immunohistochemical staining，×200).A:3 d nanogold treatment group;B:7 d nanogold treatment group;C:11 d nanogold treatment group;D:control group.圖2 納米金作用下不同時(shí)間窗內(nèi)Ang－2的表達(dá)情況

表1 納米金作用下不同時(shí)間窗內(nèi)Ang－1和Ang－2的陽(yáng)性率比較Table 1.Expression rates of Ang－1 and Ang－2 in H22 hepatic tumor(n=12)

2 納米金對(duì)RGS－5表達(dá)和IMPI的影響

RGS－5主要表達(dá)于細(xì)胞漿中，亦呈金黃色，見圖3。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組裸鼠在第7 d時(shí)RGS－5陽(yáng)性率最低，同時(shí)IMPI亦最低，與對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組第3 d、第11 d時(shí)比較，均顯著差異(P＜0.01或P＜0.05)，見表2、圖4。

3 電鏡下周細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

在腫瘤組織中直徑6～40 μm新生血管中，周細(xì)胞位于內(nèi)皮細(xì)胞外壁，環(huán)繞血管腔。RGS－5表達(dá)的周細(xì)胞，其胞質(zhì)中見圓形黑色顆粒，細(xì)胞壁薄，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、大小不一。RGS－5表達(dá)缺失的周細(xì)胞，其核大、胞質(zhì)豐碩，電子密度高;微飲泡較少，中間細(xì)絲豐富，細(xì)胞形態(tài)趨于正常和成熟，周圍血管無(wú)中斷現(xiàn)象，見圖5、6。

Figure 3.Expression of RGS－5 in the H22 hepatic tumor with nanogold treatment(immunohistochemical staining，×200).A:3 d nanogold treatment group;B:7 d nanogold treatment group;C:11 d nanogold treatment group;D:control group.圖3 納米金作用下不同時(shí)間窗內(nèi)RGS－5的表達(dá)

表2 RGS－5在裸鼠肝癌組織中陽(yáng)性率Table 2.Expression of RGS－5 in H22 hepatic tumor(n=12)

討 論

腫瘤的血管生成過程復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞因子及信號(hào)通路。Ang/Tie－2是經(jīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的酪氨酸激酶受體通路，Tie－2的配體是Ang－1和Ang－2。Ang－1是激動(dòng)劑而Ang－2是拮抗劑，二者共同競(jìng)爭(zhēng)性作用于內(nèi)皮細(xì)胞膜上特異性受體Tie－2發(fā)揮調(diào)節(jié)血管生長(zhǎng)的作用［7］。在正常組織中Ang－1/Ang－2處于一種相對(duì)平衡，在腫瘤組織中Ang－2被大量表達(dá)，它競(jìng)爭(zhēng)性抑制Ang－1/Tie－2作用，使內(nèi)皮細(xì)胞外周緊密結(jié)構(gòu)松馳，新生微血管迅速生長(zhǎng)，加速腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［8］。

Figure 4.IMPI in different groups..n=12.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs 7 d nanogold treatment.圖4 各組間IMPI的比較

Figure 5.Mature pericytes surrounding the normalized vascular walls were found under electronic microscopeed(A，B:×8000;C:10000).A:mature pericytes covered microvascular intima completely.B:the pericyte were of normal shape，uniform size and orderly arrangement.C:organelles were clearly visible in a single pericyte.圖5 電鏡觀察正常化血管的血管壁周細(xì)胞

Figure 6.Electronic microscope image of immature pericytes in control group(×10000).A:immature pericytes covered microvascular intima in completely;B，C:the pericytes were of irregular shape，nonuniform size and loose arrangement.圖6 電鏡觀察對(duì)照組微血管壁上的不成熟周細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)納米金處理的裸鼠Ang－1陽(yáng)性率高于對(duì)照組，Ang－2陽(yáng)性率則低于對(duì)照組。用藥7 d的裸鼠，其納米金抑制Ang－2的作用最強(qiáng)。說明納米金能抑制裸鼠肝癌組織分泌Ang－2，調(diào)節(jié)癌組織中Ang－1與Ang－2的失衡，使Ang－1表達(dá)上調(diào)、Ang－2表達(dá)下調(diào)，減少Ang－2競(jìng)爭(zhēng)性拮抗Ang－1/Tie－2作用，抑制腫瘤血管生成;其最佳時(shí)間窗為7 d左右。此時(shí)電鏡觀察新生血管外壁的周細(xì)胞多數(shù)形態(tài)均勻、排列整齊，而對(duì)照組周細(xì)胞大小不一、結(jié)合疏松。正如 Jain［1］所述，合理使用抗血管生成藥物，可以重新恢復(fù)促血管生成因子和血管生成抑制因子的平衡，使腫瘤血管系統(tǒng)趨于正常。雖然這種動(dòng)態(tài)變化的機(jī)理尚未完全闡明，但探討腫瘤血管正?；瘯r(shí)間窗可為何時(shí)聯(lián)合化療或放療提供了策略。Winkler等［9］在研究抗血管生成藥物DC101中發(fā)現(xiàn)，藥物能短暫激活A(yù)ng－1/Tie－2通路，上調(diào)Ang－1表達(dá)和下調(diào)Ang－2表達(dá)，增加成熟周細(xì)胞對(duì)腫瘤血管覆蓋，使血管直徑下降。此時(shí)腫瘤血管變得成熟，更近似于正常血管，與本研究結(jié)果一致。這亦說明Ang/Tie－2是調(diào)控腫瘤血管正?；闹匾?xì)胞信號(hào)通路之一。

RGS－5表達(dá)于周細(xì)胞中，它與血管異常狀態(tài)有關(guān)。有研究證實(shí)，在腫瘤微血管迅速生長(zhǎng)過程中，不成熟周細(xì)胞覆蓋新生血管苞芽時(shí)，RGS－5表達(dá)上調(diào);此時(shí)周細(xì)胞形態(tài)異常，與血管壁結(jié)合松散、向腫瘤組織內(nèi)嵌入，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋、包繞不完整，血管外壁連接不致密，血管腔滲漏性增加，加速腫瘤細(xì)胞沿血管壁向周圍組織的侵潤(rùn)［4］。在RGS－5缺失的胰島素瘤小鼠和野生型胰島素瘤小鼠動(dòng)物模型中，野生型胰島素瘤小鼠的血管排列紊亂，形成了一個(gè)低氧環(huán)境，而RGS－5缺失的胰島素瘤小鼠其腫瘤血管特征被顯著改變，血管排列有規(guī)則，看上去與正常組織血管類似［10］。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)在納米金處理的裸鼠肝癌組織中RGS－5表達(dá)的陽(yáng)性率低于對(duì)照組，IMPI也低于對(duì)照組。并且在用藥7 d的時(shí)間窗內(nèi)，納米金抑制RGS－5表達(dá)作用最強(qiáng)。這說明納米金能通過抑制RGS－5蛋白表達(dá)，減少裸鼠肝癌組織中新生血管不成熟周細(xì)胞覆蓋，使腫瘤血管趨于正?；?。電鏡觀察亦發(fā)現(xiàn)RGS－5表達(dá)陰性的血管壁上周細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整、形態(tài)正常;而對(duì)照組周細(xì)胞與基底膜及內(nèi)皮細(xì)胞連接疏松。

納米金是金的微細(xì)顆粒，直徑在1～100 nm之間，與生物大分子蛋白質(zhì)、核酸的大小相近。納米金易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，能被不同的化學(xué)基團(tuán)修飾，對(duì)腫瘤細(xì)胞有靶向性特性，對(duì)正常細(xì)胞幾乎無(wú)細(xì)胞毒性。目前發(fā)現(xiàn)納米金能與有肝素結(jié)合位點(diǎn)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)結(jié)合，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抗腫瘤血管生成［2，5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明納米金還能抑制Ang－2、RGS－5在裸鼠肝癌組織中表達(dá)，通過影響Angiopoietin/Tie－2及RGS－5信號(hào)通路，使腫瘤血管正?；?。其機(jī)制仍與納米金對(duì)VEGF的拮抗作用有關(guān)。VEGF是血管生長(zhǎng)的最主要因素，在腫瘤新生血管早期，VEGF刺激腫瘤組織大量分泌Ang－2［11］。納米金作為 VEGF拮抗劑，間接抑制了Ang－2表達(dá);RGS－5是一種GTP酶活化蛋白，具有激活GTP酶功能，在體內(nèi)的活性受磷酸化影響，主要磷酸化位點(diǎn)為S166［10］。納米金作為一種生物分子載體，可以進(jìn)入周細(xì)胞內(nèi)，與RGS－5殘基結(jié)合，抑制其磷酸化，改變周細(xì)胞生物活性。至于納米金通過何種信號(hào)通路影響周細(xì)胞胞漿內(nèi)RGS－5表達(dá)，我們還在進(jìn)一步研究中。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明納米金在7 d時(shí)間窗內(nèi)抑制Ang－2和RGS－5表達(dá)的作用最強(qiáng)。這時(shí)腫瘤血管趨近于正?；?，有利于化療藥物和氧氣在腫瘤組織內(nèi)運(yùn)輸，能提高放化療抗腫瘤效果。納米金能抑制腫瘤的血管生成，促進(jìn)腫瘤血管正常化;但它只能延緩腫瘤的生長(zhǎng)速度，不能徹底殺滅癌細(xì)胞、根治腫瘤。因此在腫瘤緩慢長(zhǎng)大過程中，腫瘤細(xì)胞不可避免地發(fā)生相互間擠壓、腫瘤組織間液壓升高，導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)部最終發(fā)生缺血、乏氧及pH值改變。腫瘤這種微環(huán)境變化刺激腫瘤細(xì)胞分泌各種血管生長(zhǎng)因子，拮抗藥物作用，最終促進(jìn)了腫瘤的侵潤(rùn)和生長(zhǎng)。所以探討納米金使腫瘤血管正?；臅r(shí)間窗，為進(jìn)一步聯(lián)合放療或化療提供治療策略。

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