亞硒酸鈉對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖能力的影響*

鄭軍生，周 潔，李小毛，林琛蒞

(1中山大學附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510630;2暨南大學醫(yī)學院病理學系，廣東 廣州 510632)

子宮內(nèi)膜癌是常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，其治療以手術(shù)治療為主，放療、化療及生物治療為輔。對于具高危因素的早期子宮內(nèi)膜癌、晚期子宮內(nèi)膜癌和復發(fā)性子宮內(nèi)膜癌，化療具有重要的治療作用［1］，可以明顯提高患者生存率［2］。目前化療已成為術(shù)后有或疑有小病灶殘留患者及有高危因素早期患者術(shù)后的首選后續(xù)治療方案［2－4］。常用的化療藥物為阿霉素、鉑類、環(huán)磷酰胺、紫杉醇等，聯(lián)合化療療效優(yōu)于單藥化療。但是化療藥物種類越多，副反應(yīng)越大［5］，子宮內(nèi)膜癌的最佳化療方案至今尚無定論。

硒(selenium)元素是人類和動物維持生命所必需的微量元素之一，是動物體內(nèi)谷胱甘肽過氧化酶的必須成分。硒與腫瘤的關(guān)系是研究最為關(guān)注的熱點之一，人群調(diào)查資料表明機體硒水平與腫瘤發(fā)生率呈負相關(guān)，包括宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肝癌、肺癌，前列腺癌［6－7］、膀胱癌［8］等。體外研究發(fā)現(xiàn)硒具有保護正常細胞、殺傷腫瘤細胞、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性［9］、調(diào)節(jié)免疫功能的優(yōu)點，有望成為新的化療藥物。在含硒化合物中對亞硒酸鈉(Na2SeO3)的研究最多。研究發(fā)現(xiàn)Na2SeO3對于多種腫瘤細胞具有體外抗腫瘤作用，但是關(guān)于其對于子宮內(nèi)膜癌細胞的作用尚無相關(guān)報導。本實驗選用了高分化子宮內(nèi)膜腺癌細胞Ishikawa細胞和中分化子宮內(nèi)膜腺癌細胞HEC－1A細胞，研究Na2SeO3在體外對這兩種細胞的增殖抑制、細胞周期改變及凋亡促進作用。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞與培養(yǎng)基 子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞和HEC－1A細胞購自中科院上海細胞庫;細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(四季青)的高糖DMEM培養(yǎng)基(HyClone)。

1.2 試劑 Na2SeO3由暨南大學化學系合成;噻唑藍［3－(4，5－dimethylthiazol－2－yl)－2，5－diphenyltetrazolium bromide，MTT］、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)、RNase A、甘油醛－3－磷酸脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔抗人單克隆抗體均購自Sigma;Annexin V/PI雙染凋亡試劑盒均購自BD Pharmingen;Cyclin A兔抗人單克隆抗體均購自博奧森。

1.3 儀器 全波長自動酶標儀(BioTek);流式細胞儀(BD Calibur)，其余實驗儀器設(shè)備均為暨南大學病理學教研室提供。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 子宮內(nèi)膜癌Ishikawa及HEC－1A細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的恒溫密閉式培養(yǎng)箱(相對濕度為95%)內(nèi)傳代培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期細胞用于實驗。

2.2 MTT法測定細胞增殖能力 將細胞接種于96孔板中，Ishikawa細胞8000 cells/well，HEC－1A細胞4000 cells/well，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，24 h后加入含Na2SeO3的培養(yǎng)液，使各孔終濃度為目的濃度。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去培養(yǎng)液，每孔加入 150 μL DMSO，振蕩 10 min，使結(jié)晶物充分溶解，全波長自動酶標儀檢測570 nm處各孔的吸光度值。

2.3 流式細胞法檢測細胞周期 將細胞以Ishikawa細胞 1.5×106cells/well、HEC－1A細胞 2×106cells/well的密度接種至6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入1.5 mL含目的濃度Na2SeO3的DMEM培養(yǎng)液。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h后收集細胞，分別收集各組培養(yǎng)液及懸浮細胞，胰酶消化各孔貼壁細胞，制成單細胞懸液，與收集的懸浮細胞一起離心，1500 r/min離心2 min，用 1 mL 0.01 mol/L PBS洗滌 2次，轉(zhuǎn)入1.5 mL的EP管中，離心，棄上清，加入1 mL 4℃預冷的70%乙醇，重懸后于4℃固定過夜。次日1800 r/min離心5 min，棄固定液。用0.01 mmol/L PBS洗滌1次，離心沉淀，吸棄上清。加入20 μL 1 g/L RNase A，37 ℃ 水浴 30 min，加 500 μL 100 mg/L PI染色液吹打均勻，至4℃避光10 min后上機檢測細胞周期。

2.4 流式細胞法檢測細胞凋亡 將細胞以Ishikawa細胞 1.5×106cells/well、HEC－1A細胞 2×106cells/well的密度接種至6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入1.5 mL含目的濃度Na2SeO3的DMEM培養(yǎng)液。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h后收集細胞，分別收集各組培養(yǎng)液及懸浮細胞，胰酶消化各孔貼壁細胞，制成單細胞懸液，與收集的懸浮細胞一起離心，1500 r/min離心2 min，用1 mL 0.01 mol/L PBS洗滌1次，轉(zhuǎn)入1.5 mL的EP管中，用Annexin V/PI雙染凋亡試劑盒處理后上機檢測細胞凋亡。

2.5 Western blotting檢測cyclin A表達 將細胞以Ishikawa細胞1.5×106cells/well、HEC－1A細胞2×106cells/well的密度接種至6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入1.5 mL含目的濃度Na2SeO3的DMEM培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，提取細胞蛋白，用BCA試劑盒(碧云天)測定蛋白濃度，用SDS－PAGE電泳分離蛋白，5%濃縮膠恒流0.02 A 20 min，10%分離膠恒流0.04 A 40 min，恒流0.35 A轉(zhuǎn)膜1 h，TBS－T將膜漂洗3次，封閉液在室溫下?lián)u床封閉1 h。然后加入cyclin A兔單抗(1∶200)和 GAPDH 兔單抗(1∶4000)，4 ℃ 搖床，孵育過夜，TBS－T洗膜，10 min×3次，再分別用HRP標記的兔Ⅱ抗(cyclin A用1∶3000，GAPDH用1∶6000)室溫孵育1 h。在暗室中顯影。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 MTT檢測細胞增殖能力結(jié)果

不同濃度的Na2SeO3作用于子宮內(nèi)膜癌Ishika-wa細胞和HEC－1A細胞48 h后，細胞增殖能力受到明顯抑制。Na2SeO3濃度在Ishikawa細胞2～6 μmol/L、HEC －1A 細胞 3～6.5 μmol/L 內(nèi)，兩種細胞的抑制率與藥物濃度呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)，作用48 h，對 Ishikawa 細胞的 IC50為 3.26 μmol/L，對HEC －1A 細胞的 IC50為4.77 μmol/L，見圖1、2。

Figure 1.The growth inhibitory rate of Na2SeO3on endometrial cancer Ishikawa cells..n=3.r=0.966，P＜0.05.圖1 Na2SeO3對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞的抑制率

Figure 2.The growth inhibitory rate of Na2SeO3on endometrial cancer HEC－1A cells..n=3.r=0.983，P＜0.05.圖2 Na2SeO3對子宮內(nèi)膜癌HEC－1A細胞的抑制率

2 藥物作用后細胞形態(tài)變化

Na2SeO3處理子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞和HEC－1A細胞48 h后，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化顯示，藥物處理組的細胞密度、細胞數(shù)明顯少于對照組，細胞皺縮、可見凋亡小體形成，見圖3。

3 流式細胞法檢測Na2SeO3處理后細胞周期結(jié)果

Figure 3.The morphology of Ishikawa cells and HEC－1A cells with or without Na2SeO3treatment for 48 h(×200).圖3 Na2SeO3作用前后Ishikawa細胞和HEC－1A細胞的形態(tài)變化

用 2 μmol/L、3 μmol/L、5 μmol/L Na2SeO3作用于子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞48 h后，G0/G1期細胞的比例減少，且與Na2SeO3濃度呈負相關(guān)，S期細胞的比例升高，與亞硒酸鈉濃度呈劑量依賴性。G2/M期細胞比例有增加趨勢，其濃度依賴性無顯著差異。4 μmol/L、5 μmol/L、6 μmol/L Na2SeO3作用于子宮內(nèi)膜癌HEC－1A細胞48 h后，G0/G1期細胞的比例明顯減少，且與藥物濃度呈劑量依賴性(P＜0.05)。S期細胞的比例升高，與藥物濃度呈劑量依賴性，G2/M期的比例相較于對照組增加，但與Na2SeO3濃度未表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性，見表1、2及圖4。

表1 Na2SeO3對Ishikawa細胞周期的影響Table 1.The cell cycle distribution of Ishikawa cells treated with Na2SeO3(%..n=3)

表1 Na2SeO3對Ishikawa細胞周期的影響Table 1.The cell cycle distribution of Ishikawa cells treated with Na2SeO3(%..n=3)

*P ＜0.05 vs 0 μmol/L;▲P ＜0.05 vs 2 μmol/L.

043.33 ±0.82 39.10 ±0.66 17.80 ±0.26231.76 ±1.14* 51.99 ±2.04* 19.05 ±0.35318.42 ±0.91＊▲ 55.22 ±1.08＊▲ 26.36 ±1.92*8.96 ±4.02 35.76 ±31.07 55.28 ±27.065

表2 Na2SeO3對HEC－1A細胞周期的影響Table 2.The cell cycle distribution of HEC－1A cells treated with Na2SeO3(%..n=3)

表2 Na2SeO3對HEC－1A細胞周期的影響Table 2.The cell cycle distribution of HEC－1A cells treated with Na2SeO3(%..n=3)

*P ＜0.05 vs 0 μmol/L;▲P ＜0.05 vs 4 μmol/L.

/M Na2SeO3(μmol/L) G0/G1 S G2

Figure 4.The effect of Na2SeO3on the cell cycle distribution of Ishikawa cells.圖4 Na2SeO3對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞周期的影響

Figure 5.The effect of Na2SeO3on the cell cycle distribution of HEC －1A cells.圖5 Na2SeO3對子宮內(nèi)膜癌HEC－1A細胞周期的影響

4 AnnexinⅤ/PI雙染法測定細胞凋亡的結(jié)果

用 2 μmol/L、3 μmol/L、5 μmol/L Na2SeO3作用于子宮內(nèi)膜癌 Ishikawa 細胞48 h，4 μmol/L、5 μmol/L、6 μmol/L Na2SeO3作用于子宮內(nèi)膜癌 HEC －1A細胞48 h后檢測細胞凋亡結(jié)果見表3、4和圖6、7。Ishikawa細胞經(jīng)5 μmol/L Na2SeO3作用后凋亡率增加，差異顯著。對照組HEC－1A細胞的凋亡率為7.6%，5 μmol/L 和6 μmol/L Na2SeO3作用后凋亡率分別為12.9%和21.9%，差異顯著。說明凋亡率隨藥物濃度的升高呈升高趨勢。

表3 Na2SeO3對Ishikawa細胞凋亡的影響Table 3.The effect of Na2SeO3on the apoptosis of Ishikawa cells(%)

表4 Na2SeO3對HEC－1A細胞凋亡的影響Table 4.The effect of Na2SeO3on the apoptosis of HEC－1A cells(%)

5 Western blotting檢測cyclin A表達的結(jié)果

與對照組(加藥濃度為0 μmol/L)比較，Na2SeO3作用后兩種細胞cyclin A表達增加，并隨著藥物濃度的增加呈增加趨勢，見圖8。

討 論

自從發(fā)現(xiàn)硒的抗腫瘤作用以來，其對多種腫瘤細胞的增殖能力的影響已有眾多的研究，作為FDA認可的抑癌劑，硒對于腫瘤細胞的體外增殖抑制作用已被廣泛認可。亞硒酸鈉是研究最廣、研究時間最長的含硒化合物，關(guān)于亞硒酸鈉對腫瘤細胞的生長抑制作用已有眾多研究，但是對于不同腫瘤細胞的有效作用濃度不同，且相差較大，有報道其對肝癌HepG2細胞的有效濃度為2 ～4mmol/L［10］，本研究中發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉對Ishikawa細胞作用48 h的IC50為3.26 μmol/L，對 HEC －1A 細胞作用 48 h的 IC50為4.77 μmol/L。說明較低的亞硒酸鈉濃度即可對子宮內(nèi)膜癌細胞起到抑制增殖的作用。

Figure 6.The effect of Na2SeO3on the apoptosis of Ishikawa cells.圖6 Na2SeO3對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞凋亡的影響

Figure 7.The effect of Na2SeO3on the apoptosis of HEC－1A cells.圖7 Na2SeO3對子宮內(nèi)膜癌HEC－1A細胞凋亡的影響

Figure 8.The expression of cyclin A of Ishikawa(A)and HEC－1A(B)cells treated with Na2SeO3..n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L.圖8 Na2SeO3對cyclin A表達的影響

抗腫瘤藥物的抗腫瘤作用主要是通過殺傷細胞、阻滯細胞周期及誘導細胞凋亡來實現(xiàn)的［11］，韓曉紅等［12］關(guān)于亞硒酸鈉對結(jié)腸癌細胞抑制機制的研究表明，亞硒酸鈉可以導致 G1期阻滯的抑癌基因p16、細胞周期抑制蛋白p21表達增強，阻滯細胞周期從而使細胞增殖受阻或減慢。而p16基因的任何缺失和突變都可以導致細胞異常增殖，誘發(fā)腫瘤。另外亞硒酸鈉能夠下調(diào)增殖細胞核抗原(PCNA)基因。PCNA是DNA聚合酶的輔助因子，其下調(diào)可使細胞DNA合成減少，從而抑制細胞增殖［13］。有研究發(fā)現(xiàn)硒化合物誘導細胞凋亡不需要p53的參與，考慮硒可以直接影響細胞周期素，使細胞不能通過S期，抑制細胞的增殖［14－15］。也有研究顯示，亞硒酸鈉對肺腺癌細胞起G0/G1期阻滯作用［16］，通過直接損傷細胞DNA，DNA損傷時促進細胞從G0/G1期進入S期的周期素Cyclin D3表達減弱，使細胞阻滯在G0/G1期，阻止DNA的合成，同時誘導DNA修復基因轉(zhuǎn)錄，使DNA損傷得到修復。如果G0/G1期阻滯未實現(xiàn)則進入S期，激活存在于細胞質(zhì)中的caspase前體，轉(zhuǎn)化為有活性的caspase－3，同時Bcl－2表達降低，啟動細胞凋亡［17－19］。因而考慮亞硒酸鈉對不同腫瘤細胞表現(xiàn)的周期阻滯作用點不同，這可能與亞硒酸鈉對不同細胞引起的DNA損傷程度不同有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉作用后，子宮內(nèi)膜癌細胞的G1期細胞比例減少，S期細胞比例增多，G2/M期細胞比例增多，考慮亞硒酸鈉可以使子宮內(nèi)膜癌細胞發(fā)生S期阻滯或者G2/M期阻滯?？赡茉蚴莵單徕c對子宮內(nèi)膜癌細胞DNA損傷作用較大，無法得到修復，因而G0/G1期阻滯未實現(xiàn)，細胞進入S期，激活存在于細胞質(zhì)中的caspase前體，轉(zhuǎn)化為有活性的caspase－3，同時Bcl－2表達降低，啟動細胞凋亡。Cyclin A是S期特征性蛋白，在G1晚期開始增多，當細胞由G1期進入S期時其合成增加，S期和G2期表達最多，研究中發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉作用后，子宮內(nèi)膜癌細胞的cyclin A表達增加，進一步說明S期細胞的比例增多。同時cyclin A也是S期向G2期轉(zhuǎn)變的調(diào)控蛋白，其表達增多促進部分細胞由S期進入G2期，導致G2/M期細胞比例增多。而亞硒酸鈉作用后cyclin A表達增加，推測與DNA損傷有關(guān)［20］。

關(guān)于亞硒酸鈉對腫瘤細胞的促凋亡作用也有較多研究，余煥玲等［21］研究亞硒酸鈉對神經(jīng)皮質(zhì)細胞的氧化損傷作用說明，亞硒酸鈉可以誘導促凋亡基因bax、p53、c－fos等表達上調(diào)，并且誘導抑制凋亡基因bcl－2表達下調(diào)。而在凋亡相關(guān)基因的表達中，bax、p53、c－fos和 bcl－2 的變化與凋亡的早期事件有關(guān)，可以誘發(fā)早期凋亡。亞硒酸鈉也可以上調(diào)抑癌基因p16、細胞周期抑制蛋白p21，下調(diào)增殖細胞核抗原 PCNA［13］，增加凋亡蛋白 caspase － 3［19］。雖然既往曾有學者研究亞硒酸鈉對喉癌細胞和白血病細胞的殺傷作用［22－23］，但目前尚缺乏亞硒酸鈉對子宮內(nèi)膜癌細胞作用的相關(guān)資料，我們的結(jié)果表明，亞硒酸鈉對子宮內(nèi)膜癌細胞有抑制增殖的作用，且可以誘發(fā)S期阻滯和G2/M期阻滯、促進凋亡。推測其作用機制為大量DNA嚴重損傷的細胞，無法得到修復，從而直接進入凋亡途徑。

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