短期高果糖喂養(yǎng)對小鼠肝臟脂質沉積和胰島素敏感性的影響*

任路平，宋光耀，章冬梅，孫 文，李 凡，陳樹春

(河北省人民醫(yī)院內分泌一科，河北 石家莊 050051)

近年來，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)病率逐漸增加，非酒精性脂肪肝與代謝綜合征關系密切［1］。大部分非酒精性脂肪肝病患者為單純性脂肪肝，也簡稱為“脂肪肝”，膳食因素如脂類過量攝入與脂肪肝的發(fā)生發(fā)展有關［2］。隨著含果糖的軟飲料如可樂、果汁等的攝入量逐年增加，果糖對機體糖脂代謝的影響也引起了人們的重視。既往研究表明慢性高果糖喂養(yǎng)后可誘導嚙齒類動物發(fā)生肝內脂質沉積和胰島素抵抗［3］，但是關于短期高果糖過量攝入對肝臟脂質沉積和肝胰島素敏感性的影響研究較少。本研究旨在通過高果糖飲食喂養(yǎng)小鼠3 d，觀察高果糖攝入對肝臟糖脂代謝的危害，并探討脂肪肝發(fā)生的早期機制及其與肝胰島素抵抗的關系。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 成年雄性C57BL/J6小鼠按隨機數(shù)字表隨機分為對照(control)組及高果糖(HFru)組，20只/組，體重25～30 g。對照組進食普通飼料;高果糖組果糖占總熱量34.5%(高果糖飼料配方參考文獻［4］，具體配方為:果糖34.5%，淀粉34.5%，脂肪9%，蛋白21%)。兩組每天進食熱量基本相等，喂養(yǎng)3 d后行相關指標測定并處死小鼠，留取組織。

1.2 試劑 兔抗鼠乙酰輔酶A羧化酶(acetyl－CoA carboxylase，ACC)、硬脂酰輔酶 A脫飽和酶 －1(stearoyl－CoA desaturase 1，SCD －1)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p－Akt)和總蛋白激酶B(total protein kinase B，t－Akt)、磷酸化糖原合成激酶－3(phosphorylated glycogen synthase kinase 3，p－GSK －3α/β)和總糖原合成激酶 －3(total glycogen synthase kinase 3，t－ GSK －3α/β)抗體均由 Cell Signaling 提供(#3662、#2438、#9271、#9272、#9331和#7291)，兔抗鼠脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)抗體由 ABCAM公司提供(ab9686)，內參照抗體pan 14－3－3由ABCAM提供(ab12341)。

2 檢測指標及方法

2.1 小鼠腹腔葡萄糖耐量試驗(intraperitoneal glucose tolerance test，ipGTT) 各組小鼠喂養(yǎng)3 d后，隨機選取6只，過夜禁食12 h，后采尾血測定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)(Roche血糖儀)，其后經腹腔注射3 g/kg葡萄糖，于注射葡萄糖后30、60、90 min分別采尾血測定全血葡萄糖。通過0、30、60、90 min 各時點血糖值(FBG、BG30min、BG60min、BG90min)計算血糖曲線下面積(area under curve，AUC)，AUC=(FBG+BG30min)×30/2+(BG30min+BG60min)×30/2+(BG60min+BG90min)×30/2。以進一步反映各組小鼠葡萄糖耐量。

2.2 肝臟病理變化檢查 取新鮮肝組織1塊(約10 mm×10 mm×2 mm)，置于10%中性甲醛液中固定，經梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，制成厚度為3 μm切片，行蘇木素－伊紅(HE)染色，中性樹膠封固。

2.3 肝臟甘油三酯(triglyceride，TG)測定 取肝臟組織30 mg經氯仿/甲醇抽提甘油三酯后，加入0.6%NaCl分離水相和有機相，吸取有機相待干燥后溶于100%乙醇500 μL，應用GPO－PAP試劑盒測定TG含量(Boehringer Mannheim)。

2.4 Western blotting方法檢測蛋白表達 于肝臟組織勻漿中加入10倍裂解液，13000 r/min離心15 min，BCA法測蛋白含量。取20 μg蛋白進行10%聚丙烯凝膠電泳，濕法電轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入1∶1000稀釋的抗體，4℃搖床過夜，TTBS緩沖液洗膜后加入1∶10000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體，室溫孵育1 h，最后用ECL化學發(fā)光法檢測，膜與化學發(fā)光底物孵育，經X膠片曝光顯影。用ImageJ軟件分析，以目的蛋白的灰度值除以內參照pan 14－3－3的灰度值以校正誤差，所得結果代表某樣品的目的蛋白相對含量。每組隨機選6例樣本進行蛋白表達分析。

2.5 肝臟胰島素敏感性評估 于喂養(yǎng)3 d后每組隨機取12只小鼠，禁食10 h過夜，每組小鼠隨機選取6只小鼠注射生理鹽水，另向6只小鼠腹腔內注射含有葡萄糖3 g/kg BW、胰島素2 U/kg的混合溶液，于注射后40 min處死小鼠，其后留取肝臟、肌肉和脂肪組織，凍存于－70℃。應用Western blotting方法測定前述胰島素葡萄糖混合溶液注射后40 min小鼠肝臟組織的2個重要胰島素信號轉導因子Akt和GSK－3α/β總蛋白和磷酸化蛋白的表達。通過比較各組注射與未注射胰島素溶液的小鼠p－Akt/t－Akt和p－GSK－3α/β/t－GSK －3α/β 表達變化評估胰島素敏感性，比值減少代表肝細胞內胰島素信號轉導通路蛋白Akt和GSK－3α/β的磷酸化減少，提示肝臟胰島素敏感性下降。Western blotting檢測同方法2.4。

3 統(tǒng)計學處理

在SPSS 11.0軟件上進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差()表示。組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

結 果

1 喂養(yǎng)3 d后兩組小鼠各項指標檢測結果

各組小鼠實驗起始體重無差異，不同飼料喂養(yǎng)3 d后體重均無明顯增長，但高果糖組附睪脂肪含量明顯高于對照組(P＜0.01)。高果糖組的血葡萄糖與對照組無差異，但ipGTT實驗后的血糖曲線下面積明顯高于對照組(P＜0.01)，提示存在機體胰島素抵抗。與對照組相比，高果糖組的肝臟TG水平顯著增高(P ＜0.01)，見表1。

2 肝臟病理變化

肝組織HE染色切片顯示對照組小鼠肝小葉結構清晰，肝細胞索排列整齊，脂滴少見;高果糖組小鼠肝細胞脂滴數(shù)量明顯增多，部分肝細胞脂肪變性，多數(shù)肝細胞結構尚完整，見圖1。

表1 兩組小鼠喂養(yǎng)3 d后的各項指標Table 1.Comparison of parameters in the 2 groups of mice after 3－day feeding(.n=20)

表1 兩組小鼠喂養(yǎng)3 d后的各項指標Table 1.Comparison of parameters in the 2 groups of mice after 3－day feeding(.n=20)

＊＊P ＜ 0.01 vs control.FBG:fasting blood glucose;AUC:area under curve.

Group Body weight(g) Epdydimal fat(g/100 g BW) FBG(mmol/L) AUC of ipGTT TG content in liver(μmol/g)Control 26.2 ±0.6 1.2 ±0.1 6.2 ±0.1 1014 ±39 10.05 ±0.34 HFru 25.1 ±0.5 1.6 ±0.1＊＊ 6.3 ±0.2 1399 ±54＊＊ 23.42 ±3.96＊＊

Figure 1.Pathological changes of liver tissues in mice after 3－day feeding(HE staining，×400).A:control group;B:HFru group.圖1 小鼠喂養(yǎng)3 d后肝臟病理變化

3 兩組肝臟脂質合成相關酶類表達情況

與對照組相比，高果糖組脂質合成相關酶類ACC、FAS和SCD－1的表達均明顯增加(P＜0.01)，提示高果糖組內源性脂質合成增加，見圖2。

4 兩組肝臟胰島素敏感性評估

與對照組相比，高果糖組小鼠基礎狀態(tài)時p－Akt/t－ Akt和 p － GSK －3α/β/t－ GSK －3α/β 的比值無明顯差異(P＞0.05);胰島素注射40 min后，與對照組相比，高果糖組p－Akt/t－Akt顯著減少(P＜0.01)，差異顯著;與對照組相比，高果糖組的p－ GSK －3α/β/t－ GSK －3α/β 的比值亦顯著減少(P＜0.01)，差異顯著(P＜0.01)，提示高果糖組小鼠的肝臟對胰島素敏感性減低，胰島素信號轉導減弱，見圖3。

討 論

肝臟是人體功能最活躍的合成和分解代謝器官之一，肝臟對糖、脂、蛋白的代謝均有直接的影響。本研究證明了3 d高果糖喂養(yǎng)即可引起小鼠肝臟脂質沉積，表現(xiàn)為甘油三酯含量增高和肝細胞內脂滴形成，說明肝臟對飲食因素具有非常迅速的反應，也證實了果糖對肝臟和機體代謝的危害［5］。

Figure 2.Protein expression of lipogenic enzymes in mouse livers in the 2 groups.A:ACC;B:FAS;C:SCD － 1.＊＊ P ＜0.01 vs control.圖2 兩組小鼠肝臟脂代謝相關酶類蛋白表達的變化

果糖為己糖單糖，為葡萄糖的同分異構體。自然界中果糖以游離狀態(tài)大量存在于水果的漿汁和蜂蜜中;加工食品如軟飲料、糖果、面包等中的蔗糖與高果糖玉米糖漿(high－fructose corn syrup，HFCS)含有多量果糖。自上世紀70年代HFCS引入食品加工業(yè)，果糖的人群攝入量也相應增加［6］。既往研究發(fā)現(xiàn)慢性高果糖喂養(yǎng)刺激肝臟脂質從頭合成而誘導脂肪肝的發(fā)生［7］。通過本研究表明，果糖過量攝入對肝臟脂質代謝有直接而迅速的影響，可在3 d之內就引起肝臟的脂質沉積。肝臟脂質從頭合成關鍵酶為ACC、FAS和SCD－1，本研究發(fā)現(xiàn)3 d果糖過量攝入后肝臟FAS、ACC、SCD－1的表達即明顯增加，使脂肪酸從頭合成途徑增強，提示與長期高果糖喂養(yǎng)相同，脂質從頭合成增強是短期高果糖飲食引起脂肪肝的重要機制之一。

Figure 3.The change in phosphorylation of Akt and GSK －3α/β in mouse livers after insulin stimulation.＊＊P ＜0.01 vs control+Ins.圖3 兩組小鼠胰島素刺激后肝臟Akt和GSK－3α/β的磷酸化變化

同時，高果糖喂養(yǎng)3 d后的小鼠糖耐量試驗表明機體的糖耐量已經下降，同時伴有小鼠附睪脂肪增多。本研究進一步評價了小鼠肝臟的胰島素敏感性。已知磷脂酰激醇－3激酶(PI－3K)－PKB(亦稱Akt)途徑是將胰島素作用向肝細胞內轉導的主要信號途徑之一。胰島素受體底物Akt是胰島素信號轉導途徑中位于PI－3K下游重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶，GSK －3α/β 是 Akt的直接底物［8］。因此，本研究選用Akt和GSK－3α/β作為評價小鼠肝臟胰島素敏感性的指標，經胰島素注射40 min后，與對照組相比，高果糖喂養(yǎng)小鼠的肝臟胰島素信號通路下游因子Akt和GSK－3α/β的磷酸化蛋白表達均顯著降低，表明高果糖喂養(yǎng)小鼠的肝臟胰島素敏感性均下降，出現(xiàn)了肝臟胰島素抵抗。以上對整體糖耐量和肝臟胰島素敏感性的評估結果表明，短期過量的果糖攝入對小鼠肝臟脂代謝和肝胰島素敏感性均有不利的影響。另外，3 d高果糖喂養(yǎng)誘導小鼠肝臟同時出現(xiàn)甘油三酯沉積和肝臟胰島素抵抗，提示脂肪肝和肝胰島素抵抗密切相關，為并行出現(xiàn)機體代謝障礙的表現(xiàn);然而，本研究結果尚不能確定肝臟胰島素抵抗和脂肪肝發(fā)生發(fā)展的先后關系和因果關系，二者的關系還需進一步深入研究。

綜上所述，本研究提示短期高果糖飲食通過刺激內源性肝臟脂質合成引起脂肪肝和肝臟胰島素抵抗，并伴有小鼠機體糖耐量減低，揭示了高果糖飲食對肝臟及全身代謝的危害與脂肪肝和胰島素抵抗有密切聯(lián)系。

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