氧化應(yīng)激和P53參與波動高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡*

李素娟，李劍敏，汪 洋，王萬鐵，邱曉曉，許益笑，金可可△

(溫州醫(yī)學院1病理生理教研室，2附屬第一醫(yī)院病理科，浙江 溫州 325035;3中國人民解放軍第八二醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 淮安 223001)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者常見而嚴重的慢性并發(fā)癥，高血糖導致的腎臟細胞凋亡參與糖尿病腎病的發(fā)生、進展［1］。近年資料報道，糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展不僅與整體血糖控制水平密切相關(guān)，也與血糖波動性密切相關(guān)。血糖波動性越大，糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生率越高，預后越差［2］。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠血糖明顯波動可加速腎小管上皮細胞凋亡［3］。研究表明，急性血糖波動要比持續(xù)的高血糖狀態(tài)更能促進氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生［4－5］;P53與細胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)［6］。因此，本研究旨在觀察氧化應(yīng)激和P53蛋白在波動性高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡中的作用，以探討波動性高糖比穩(wěn)定性高糖引起更嚴重的腎小管上皮細胞凋亡的機制。

材料和方法

1 材料

DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco，腎小管上皮HK－2細胞株購于北京協(xié)和醫(yī)科大學細胞中心;P53抑制劑PFT－α、抗氧化劑N－乙酰半胱氨酸(N－acetyl－L－cysteine，NAC)購自碧云天生物技術(shù)研究所;鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)及枸櫞酸鈉分析純購于Sigma;普通速效胰島素(10 mL，400 U)購于江蘇萬邦生化有限公司;強生(Johnson)穩(wěn)步倍加血糖儀及試紙購于美國強生;丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;TUNEL試劑盒購自Hoffmann－La Roche;非生物素標記的即用型免疫組化Ⅱ抗試劑盒購自武漢博士德生物科技有限公司;兔抗大鼠P53和p－P53單克隆抗體購自Cell Signaling Technology;兔抗大鼠NADPH氧化酶(NADPH oxidase，Nox4)購自北京博奧森生物科技有限公司;PVDF膜購自Bio－Rad。

2 方法

2.1 腎小管上皮細胞培養(yǎng)和分組 HK－2細胞復蘇后，用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液，置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，達90%融合后更換含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h后進行實驗。將細胞分為5組:正常對照組(葡萄糖5.5 mmol/L)、穩(wěn)定高糖組(葡萄糖25 mmol/L)、波動高糖組(24 h交替葡萄糖5.5 mmol/L和25 mmol/L)、波動高糖+抗氧化劑組(24 h交替葡萄糖5.5 mmol/L+NAC和25 mmol/L+NAC)和波動性高糖+P53抑制劑組(24 h交替葡萄糖5.5 mmol/L+PFT－α和25 mmol/L+PFT－α)。NAC 濃度為10 mmol/L，PFT－ α 濃度為50 μmol/L，共培養(yǎng)5 d。

2.2 實驗動物及模型復制 180～220 g雄性SD大鼠由本校實驗動物中心提供，隨機取10只作為正常對照組(A)，其余采用STZ按65 mg/kg腹腔注射誘發(fā)糖尿病，注射STZ 72 h后，尾部取血，測空腹血糖和刺激大鼠膀胱測尿糖，血糖＞16.7 mmol/L、尿糖+++以上為造模成功，隨機取DM大鼠分為穩(wěn)定高血糖組(B)和血糖波動組(C)，血糖波動組每天定時腹腔注射速效胰島素，并錯時給予葡萄糖，造成1 d中血糖濃度大幅度波動模型。C組12周內(nèi)每天血糖波動模式相似，且糖化血紅蛋白(glycohemoglobin，HbAlc)C組［(10.50±0.69)%］與 B組［(10.13±0.96)%］比較無顯著差異(P＞0.05)，提示波動性高血糖造模成功。12周后取腎臟組織用于指標測定。

2.3 氧化應(yīng)激指標測定 取HK－2細胞培養(yǎng)上清液，化學比色法測定SOD活性及MDA的含量，操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.4 免疫組化檢測腎臟Nox4和P53蛋白表達 采用SABC法，DAB顯色。檢測方法嚴格按說明書操作。光鏡下觀察，陽性反應(yīng)為細胞漿呈棕黃色染色，不染色者為陰性。

2.5 Western blotting檢測HK－2細胞和腎臟P53蛋白表達 細胞經(jīng)相應(yīng)處理后加裂解液，超聲裂解，吸取上清液，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。取10μg蛋白上樣于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，封閉1.5 h，加入1∶1000稀釋的 p－P53、P53抗體和GAPDH抗體(內(nèi)參照)，4℃過夜。Ⅰ抗反應(yīng)結(jié)束后，加1∶3000稀釋的辣根過氧化物酶標記的特異性Ⅱ抗室溫孵育2 h，ECL試劑顯色并曝光成像，掃描并分析吸光度值。

2.6 流式細胞術(shù)檢測HK－2細胞凋亡 收集各組細胞懸液，PBS洗滌2次，加結(jié)合緩沖液懸浮細胞，調(diào)節(jié)細胞數(shù)為1×109/L，取500 μL的細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V － FITC 和 5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶液，充分混勻后，于室溫避光孵育15 min，再向反應(yīng)管中加入500 μL結(jié)合緩沖液，上流式細胞儀(Beckman Coulter)檢測分析，共重復3次。

2.7 TUNEL檢測腎臟細胞凋亡 檢測方法嚴格按說明書操作。細胞核中有綠色熒光者為陽性細胞，即凋亡細胞。計算5個高倍視野(×400)下的凋亡細胞數(shù)，以凋亡細胞/100個細胞表示凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 波動性高糖對培養(yǎng)的腎小管上皮細胞氧化應(yīng)激的影響

與正常對照組比較，其它4組的SOD活性明顯降低，且波動高糖組、波動高糖+抗氧化劑組和波動性高糖+P53抑制劑組更低于穩(wěn)定高糖組(P＜0.01);與正常對照組比較，穩(wěn)定高糖組、波動高糖組和波動性高糖+P53抑制劑組的MDA含量明顯升高，且波動高糖組和波動性高糖+P53抑制劑組高于穩(wěn)定高糖組(P＜0.01);波動高糖+抗氧化劑組的MDA含量與正常對照組比較無顯著差異(P＞0.05)，但明顯低于穩(wěn)定高糖組和波動高糖組(P＜0.01)，見表1。

2 波動性高糖對培養(yǎng)的腎小管上皮細胞P53蛋白表達的影響

穩(wěn)定高糖組和波動高糖組p－P53蛋白表達量均較對照組明顯增加，且波動高糖組明顯高于穩(wěn)定高糖組(P＜0.01);波動高糖+抗氧化劑組的p－P53蛋白表達明顯低于波動高糖組(P＜0.01);波動性高糖+P53抑制劑組的p－P53蛋白表達與正常對照組比較差別無顯著(P＞0.05)，但明顯低于其它3組(P ＜0.01)，見圖1。

3 波動性高糖對培養(yǎng)的腎小管上皮細胞凋亡的影響

與正常對照組比較，穩(wěn)定高糖組和波動高糖組細胞凋亡率明顯增高，且波動高糖組較穩(wěn)定高糖組變化更加明顯，抗氧化劑和P53抑制劑均可明顯抑制細胞凋亡(均P＜0.01)，見表1。

4 波動性高血糖對糖尿病大鼠的腎臟Nox4的影響

Figure 1.Effects of glucose fluctuation on p－P53 protein expression in cultured renal tubular epithelial cells..n=10.＊＊P ＜0.01 vs 1;△△P ＜0.01 vs 2;##P ＜0.01 vs 3;▲▲P ＜0.01 vs 4.1:5.5 mmol/L Glu group;2:25 mmol/L Glu group;3:5.5/25 mmol/L Glu group;4:5.5/25 mmol/L Glu+NAC group;5:5.5/25 mmol/L Glu+PFT－α group Glu:glucose.圖1 波動性高糖對培養(yǎng)的腎小管上皮細胞p－P53蛋白表達的影響

與正常對照組［(3.70±0.24)%］和穩(wěn)定高血糖組［(5.48±1.01)%］比較，波動高血糖組腎小球和腎小管Nox4表達明顯增強［(9.20±1.96)%］，P＜0.01，P ＜0.05，見圖2。

5 波動性高血糖對糖尿病大鼠的腎臟P53蛋白表達的影響

免疫組化結(jié)果顯示，與A組［(2.54±0.25)%］比較，B組［(28.08±1.94)%］和 C組［(34.73±3.30)%］腎小管上皮細胞核p－P53蛋白表達均明顯增強(P＜0.01)，且C組較B組增強更加顯著，見圖3。Western blotting結(jié)果表明，C組的P53蛋白和p－P53蛋白表達量較A組和B組均明顯增加，且B組p－P53蛋白表達量明顯高于A組(P＜0.01)，見圖4。

表1 波動性高糖對培養(yǎng)的腎小管上皮細胞SOD活性、MDA含量和凋亡率的影響Table 1.Effects of glucose fluctuation on SOD activity，MDA content and apoptotic rate in cultured renal tubular epithelial cells(.n=10)

＊＊P ＜0.01 vs 5.5 mmol/L Glu;△△P ＜0.01 vs 25 mmol/L Glu;##P ＜0.01 vs 5.5/25 mmol/L Glu;★★P ＜0.01 vs 5.5/25 mmol/L Glu+NAC.

Group SOD(103U/L) MDA(μmol/L) Apoptotic rate(%)5.5 mmol/L Glu 28.11 ±4.16 1.87 ±0.45 3.61 ±1.2925 mmol/L Glu 15.51 ±2.43＊＊ 3.72 ±0.74＊＊ 14.86 ±2.27＊＊5.5/25 mmol/L Glu 7.77 ±1.61＊＊△△ 5.59 ±1.08＊＊△△ 26.44 ±2.65＊＊△△5.5/25 mmol/L Glu+NAC 8.36 ±1.49＊＊△△ 2.57 ±0.87△△## 13.27 ±3.15＊＊##5.5/25 mmol/L Glu+PFT － α 10.14 ±2.71＊＊△△ 5.55 ±0.88＊＊△△ 18.50 ±3.94＊＊△△##★★

Figure 2.The results of Nox4 immunohistochemical staining in the kidney of rats(×400).A:control;B:stable high blood glucose;C:fluctuant high blood glucose.圖2 大鼠腎Nox4表達的免疫組化染色結(jié)果

Figure 3.The results of p－P53 immunohistochemical staining in the kidney of rats(×400).A:control;B:stable high blood glucose;C:fluctuant high blood glucose.圖3 大鼠腎p－P53表達的免疫組化染色結(jié)果

Figure 4.The P53 and p－P53 protein levels in the kidney of rats were detected by Western blotting..n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 1;△△P ＜0.01 vs 2.1:control;2:stable high blood glucose;3:fluctuant high blood glucose.圖4 Western blotting檢測大鼠腎P53和p－P53蛋白表達

6 波動性高血糖對糖尿病大鼠腎臟細胞凋亡的影響

與A組腎小管上皮細胞凋亡指數(shù)［(4.97±0.70)%］比較，B組［(12.73±1.75)%］和 C組［(18.32±1.84)%］的腎小管上皮細胞凋亡指數(shù)明顯增加，且C組較B組變化更加明顯(P＜0.01)，見圖5。

討 論

大量研究表明，慢性持續(xù)性高血糖癥會導致過高的糖化反應(yīng)和氧化應(yīng)激的形成，而最近發(fā)現(xiàn)糖尿病發(fā)生的急性血糖波動是觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)的一個額外因素［7］，即血糖波動更容易引發(fā)氧化應(yīng)激［8］。Yaqoob等［9］的早期研究表明，糖尿病發(fā)生的氧化應(yīng)激對腎小管的損傷可能先于腎小球損害。本研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定性高糖、波動性高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡過程中均伴有培養(yǎng)液SOD活性降低，MDA含量增加，且波動性高糖組的上述改變更加明顯，說明波動性高糖引發(fā)的腎小管上皮細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)較穩(wěn)定性高糖組增強。在本研究中使用抗氧化劑后，出現(xiàn)波動性高糖組的氧化應(yīng)激水平下降，同時細胞凋亡率亦降低。隨后，我們對糖尿病大鼠的研究也發(fā)現(xiàn)，與穩(wěn)定高血糖組比較，波動性高血糖大鼠的腎小管Nox4表達和腎小管上皮細胞凋亡數(shù)增加均更加明顯。Nox4是NADPH氧化酶的一種重要亞型，主要在成年腎組織表達，在高血糖的作用下，NADPH氧化酶被激活，發(fā)生呼吸鏈級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生過量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，參與氧化應(yīng)激，并作為氧化應(yīng)激的中心環(huán)節(jié)［10］。以上結(jié)果提示，與穩(wěn)定性高糖比較，波動性高糖誘導的腎小管上皮凋亡增加與氧化應(yīng)激水平增高有密切關(guān)系。

Figure 5.The apoptotic cells in the kidney of rats were detected by TUNEL(×400).A:control;B:stable high blood glucose;C:fluctuant high blood glucose.圖5 TUNEL法檢測大鼠腎凋亡細胞

P53是重要的細胞凋亡調(diào)控因子，研究表明，P53參與介導氧自由基誘發(fā)的細胞凋亡。氧化應(yīng)激能增加P53的磷酸化程度，從而提高P53的穩(wěn)定性和活性，活化的P53作為轉(zhuǎn)錄因子，可以直接啟動細胞凋亡相關(guān)基因的表達，促進細胞凋亡［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定性高糖和波動性高糖作用于腎小管上皮細胞5 d后，兩組p－P53表達均明顯增加，且波動性高糖組較穩(wěn)定性高糖組增加更顯著;抗氧化劑可明顯抑制波動性高糖誘導的p－P53蛋白表達，P53特異性抑制劑能顯著降低波動性高糖誘導的細胞凋亡。本研究的在體動物實驗也表明，穩(wěn)定高血糖組和波動高血糖組腎臟p－P53蛋白表達明顯高于正常對照組，且波動高血糖組p－P53蛋白增高更加明顯。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，在波動高血糖組的腎小管上皮細胞核中p－P53蛋白表達較穩(wěn)定高血糖組明顯增強，這與其氧化應(yīng)激和凋亡程度的變化趨勢一致。以上結(jié)果提示糖尿病個體在高血糖狀態(tài)下，體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，同時抗氧化系統(tǒng)能力減弱，導致氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，而血糖波動可作為一種刺激信號，會引發(fā)更加嚴重的氧化應(yīng)激反應(yīng)。自由基對組織和細胞具有直接毒性損傷作用，尤其當細胞DNA受損后誘導p53基因激活，磷酸化P53蛋白表達增多，以終止細胞增殖，使損傷DNA得以修復;如果DNA受損細胞修復失敗，則胞核內(nèi)P53促進細胞凋亡相關(guān)基因的表達上調(diào)，從而參與內(nèi)源和外源凋亡途徑，介導細胞凋亡。

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