孫國芳，丁 浩，李菊香，洪 葵，董家龍，吳清華，程曉曙

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西省分子醫(yī)學(xué)重點實驗室，江西 南昌 330006)

Rho相關(guān)的卷曲蛋白激酶(Rho－associated coiled－coil protein kinase，ROCK)是一種具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性并與細胞凋亡相關(guān)的Rho結(jié)合蛋白［1］。ROCK有2個亞型，ROCK1 和ROCK2，由 2 種不同的基因編碼［2］。ROCK1 和ROCK2分別是活化的caspase－3和caspase－2或顆粒酶B的直接裂解產(chǎn)物［3］，而且參與了caspase介導(dǎo)的凋亡過程［4］。

本研究原代培養(yǎng)大鼠心肌細胞，一方面利用RNA干擾下調(diào)ROCK1和ROCK2的表達，另一方面制備急性缺氧損傷模型模擬臨床心肌缺血損傷誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，然后觀察心肌細胞凋亡的變化，探討ROCK1和ROCK2與心肌細胞凋亡的關(guān)系，并為與心肌細胞凋亡有關(guān)的心血管疾病的治療提供一種可能的途徑。

材料和方法

1 材料

Sprague－Dawley乳鼠(出生1～3 d)雌雄不限，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物科學(xué)部提供(動物合格證為醫(yī)動字021－9602);培養(yǎng)基DMEM和胎牛血清購自HyClone;抗α－橫紋肌肌動蛋白免疫組化試劑盒和FITC羊抗小鼠IgG購自武漢博士德;重組質(zhì)粒ROCK1－shRNA和ROCK2－shRNA購自上海吉凱;脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000購自 Invitrogen;MTT購自上海普飛生物技術(shù)有限公司;DMSO購自Amresco;Annexin V－FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基;ROCK1、ROCK2、caspase－3、p－PI3K和β－actinⅠ抗購自Santa Cruz;Ⅱ抗辣根過氧化物酶IgG購自北京中杉金橋公司。

2 方法

2.1 原代心肌細胞的培養(yǎng)及鑒定 取健康乳鼠心臟，利用0.08%胰酶和1.00%Ⅱ型膠原酶消化心肌組織，離心收集細胞以15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基充分重懸，200目濾網(wǎng)過濾細胞懸液至培養(yǎng)皿，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，經(jīng)差速貼壁2 h后，加0.1 mmol/L 5'－BrdU抑制成纖維細胞的生長。小心吸出未貼壁細胞懸液按1×109/L接種到放有蓋薄片的培養(yǎng)皿中，48 h后，取有心肌細胞生長的玻片，用37℃ PBS漂洗，4%甲醛固定，加大鼠抗α－橫紋肌肌動蛋白單克?、窨?∶50，于4℃濕盒過夜，加FITC羊抗小鼠IgG 1∶50，孵育30 min，緩沖鹽水洗2 次，DAPI封片劑染核，顯微鏡下觀察。

2.2 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染和缺氧處理 將重組質(zhì)粒ROCK1－shRNA、ROCK2－shRNA和陰性對照shRNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染大鼠心肌細胞，各質(zhì)粒序列見表1。在細胞融合率約為90%時進行轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒每孔4.0 μg，脂質(zhì)體每孔10 μL介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后換有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。因前期實驗證實，缺氧6 h時為ROCK1和ROCK2表達的最高峰，所以轉(zhuǎn)染48 h后，將細胞置于缺氧盒(Mitsubishi)中給予缺氧6 h處理。實驗分為5組:(1)空白對照組;(2)缺氧組;(3)缺氧+陰性對照shRNA組;(4)缺氧+ROCK1－shRNA組;(5)缺氧+ROCK2－shRNA組。

表1 各shRNA構(gòu)建框架序列Table 1.Sequences of the constructed frames of the shRNAs

2.3 倒置顯微鏡觀察心肌細胞搏動頻率與節(jié)律在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察1 min，計算各組心肌細胞的搏動頻率，評估搏動節(jié)律的變化。

2.4 全自動生化分析儀檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)含量 各組實驗干預(yù)后取心肌細胞培養(yǎng)液 400 μL，利用全自動生化分析儀(Beckman)測定LDH含量。

2.5 MTT檢測細胞存活率 將細胞種植在96孔板中，空白調(diào)零孔只加不含細胞的培養(yǎng)基。實驗處理后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入 150 μL DMSO，振蕩 10 min，酶標儀(Labsystems)測定492 nm處各孔吸光度(A)值。計算細胞存活率，細胞存活率=(A實驗組/A對照組)×100%。

2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 用胰酶消化收集上述各組細胞，PBS洗滌細胞2次，再用500 μL的binding buffer懸浮細胞，分別加入Annexin VFITC和PI各5 μL，最后用FACSCalibar流式細胞儀(Beckton Dickinson)檢測。

2.7 Western blotting檢測蛋白表達水平 用RIPA法取總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，取20μg進行SDS－PAGE電泳分離蛋白。蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，3%BSA液4℃封閉過夜。膜分別用ROCK1、ROCK2、caspase－3、p－PI3K 和 β －actin的Ⅰ抗(1∶200稀釋)孵育，4℃過夜，Ⅱ抗孵育2 h，DAB顯色照相。結(jié)果用LabWork 3.0 UVP軟件，以目的條帶/β－actin的灰度值進行分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗均重復(fù)3次。應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差()表示，多組間比較采用方差分析，組間分析采用q檢驗。

結(jié) 果

1 心肌細胞的鑒定

熒光顯微鏡顯示:本底(圖1A)可見細胞呈不規(guī)則星型，并伸出偽足，胞漿內(nèi)可見綠色熒光(圖1B)?？功粒瓩M紋肌肌動蛋白陽性的細胞胞漿內(nèi)有綠色熒光，即證實原代培養(yǎng)的細胞是心肌細胞。

2 shRNA轉(zhuǎn)染和缺氧后心肌細胞搏動頻率與節(jié)律的變化

空白對照組心肌細胞搏動頻率為160次/分左右，節(jié)律規(guī)整。與空白對照組相比，缺氧后心肌細胞搏動頻率明顯減慢(P＜0.01)，搏動幅度變小，節(jié)律不規(guī)整(P＜0.01)，而ROCK1－shRNA和ROCK2－shRNA的轉(zhuǎn)染能抑制缺氧導(dǎo)致的這一作用(P＜0.05或P＜0.01)。缺氧組與缺氧+陰性對照shRNA組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

Figure 1.The image of fluorescent microscopy for detecting green fluorescence in cardiomyocytes(×100).A:control;B:experiment.圖1 熒光顯微鏡檢測心肌細胞中綠色熒光結(jié)果

3 shRNA轉(zhuǎn)染和缺氧后心肌細胞培養(yǎng)液LDH活性、細胞存活率及凋亡率的變化

與空白對照組相比，缺氧后心肌細胞培養(yǎng)液LDH活性明顯升高(P＜0.01)，存活率明顯降低(P＜0.05)，凋亡率明顯升高(P＜0.01);而ROCK1－shRNA和ROCK2－shRNA的轉(zhuǎn)染能抑制缺氧導(dǎo)致的這一作用(P＜0.05或P＜0.01)。缺氧組與缺氧+陰性對照shRNA組之間差異不顯著(P＞0.05)，見表3。

4 Western blotting 檢測 ROCK1、ROCK2、caspase－3和p－PI3K蛋白表達水平

與陰性對照shRNA組相比，ROCK1－shRNA和ROCK2－shRNA的轉(zhuǎn)染能明顯沉默 ROCK1和ROCK2的表達(P＜0.05或P＜0.01)?？瞻讓φ战M與陰性對照shRNA組之間差異不顯著(P＞0.05)，見圖2。

與空白對照組相比，缺氧后心肌細胞caspase－3蛋白表達明顯升高(P＜0.05)、p－PI3K表達明顯降低(P＜0.01)，ROCK1－shRNA和 ROCK2－shRNA的轉(zhuǎn)染能抑制缺氧導(dǎo)致的這一作用(P＜0.05或P＜0.01)，缺氧組與缺氧+陰性對照shRNA組之間差異不顯著(P＞0.05)，見圖3。

討 論

ROCK是一種細胞凋亡相關(guān)的Rho結(jié)合蛋白。靜息狀態(tài)下的ROCK沒有酶活性，因為ROCK的激酶活性可能存在一種自我抑制的機制，即通過自身的折返把其催化中心(激酶域)覆蓋，這樣使得該激酶的Rho結(jié)合域(Rho－binding domain，RBD)與ATP的親和力受到抑制或使得其下游區(qū)域不能與底物結(jié)合而不被激活［5］。ROCK的活性受細胞外信號和一些胞漿蛋白的調(diào)節(jié)，ROCK接受Rho傳遞的活化信號，發(fā)生多個氨基酸位點的磷酸化而激活，并介導(dǎo)其下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應(yīng)［6］。細胞凋亡已被認為是心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的基本機制［7－8］。Caspase在細胞凋亡過程中起中樞性的作用［9－10］。而ROCK1和ROCK2分別是活化的caspase－3和caspase－2或顆粒酶B的直接裂解產(chǎn)物，而且參與了caspase介導(dǎo)的凋亡過程［3－4］。但是，下調(diào) ROCK1 和ROCK2的表達能否抑制心肌細胞的凋亡，目前未見相關(guān)報道。為此，本研究原代培養(yǎng)大鼠心肌細胞，一方面利用RNA干擾下調(diào)ROCK1和ROCK2的表達，另一方面制備急性缺氧損傷模型模擬臨床心肌缺血損傷誘導(dǎo)心肌細胞的凋亡，然后觀察心肌細胞凋亡的變化。結(jié)果顯示，缺氧損傷能促進心肌細胞的凋亡、抑制其存活，能增高caspase－3的表達、降低p－PI3K的表達;而ROCK1和ROCK2的表達下調(diào)能抑制缺氧導(dǎo)致的這一作用。

表2 shRNA轉(zhuǎn)染和缺氧后心肌細胞搏動頻率與節(jié)律的變化Table 2.The changes of beat frequency and rhythm of cardiomyocytes treated with shRNA transfection and hypoxia(.n=3)

表2 shRNA轉(zhuǎn)染和缺氧后心肌細胞搏動頻率與節(jié)律的變化Table 2.The changes of beat frequency and rhythm of cardiomyocytes treated with shRNA transfection and hypoxia(.n=3)

＊＊P ＜0.01 vs blank control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs hypoxia+negative control shRNA group.

Group Frequency(min－1)Abnormal beat(min－1)Blank control 157 ±16 1.3 ±0.4 Hypoxia 86 ±7＊＊ 17.7 ±1.8＊＊Hypoxia+negative control shRNA 83 ±12 16.4 ±1.5 Hypoxia+ROCK1 －shRNA 103 ±17# 6.5 ±0.6#Hypoxia+ROCK2 －shRNA 111 ±18## 5.7 ±0.4#

表3 shRNA轉(zhuǎn)染和缺氧后心肌細胞培養(yǎng)液LDH活性、細胞存活率及凋亡率的變化Table 3.The changes of LDH activity in culture medium，survival rate and apoptotic rate of cardiomyocytes treated with shRNA transfection and hypoxia(.n=3)

表3 shRNA轉(zhuǎn)染和缺氧后心肌細胞培養(yǎng)液LDH活性、細胞存活率及凋亡率的變化Table 3.The changes of LDH activity in culture medium，survival rate and apoptotic rate of cardiomyocytes treated with shRNA transfection and hypoxia(.n=3)

*P ＜0.05 ，＊＊P ＜0.01 vs blank control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs hypoxia+negative control shRNA group.

Group LDH(U/L) Survival rate(%) Apoptosis rate(%)Blank control 18.19 ±4.72 100 1.68 ±0.61 Hypoxia 93.17 ±10.37＊＊ 68.54 ±4.28* 41.72 ±3.58＊＊Hypoxia+negative control shRNA 94.26 ±12.87 66.22 ±3.71 42.50 ±4.13 Hypoxia+ROCK1 － shRNA 28.53 ±5.34## 88.85 ±5.46# 11.62 ±2.49##Hypoxia+ROCK2 － shRNA 36.06 ±8.79## 82.79 ±6.90# 19.50 ±3.66#

Figure 2.The changes of protein expression of ROCK1 and ROCK2 in cardiomyocytes treated with shRNA transfection.1:blank control group;2:negative control shRNA group;3:ROCK1－shRNA or ROCK2－shRNA..n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs negative control shRNA group.圖2 shRNA轉(zhuǎn)染后心肌細胞ROCK1和ROCK2的蛋白表達的變化

Figure 3.The changes of protein expression of caspase－3(cleaved caspase－3)and p－PI3K in cardiomyocytes treated with shRNA transfection and hypoxia.1:blank control group;2:hypoxia group;3:hypoxia+negative control shRNA group;4:hypoxia+ROCK1－shRNA group;5:hypoxia+ROCK2－shRNA group..n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs blank control group;#P＜0.05，##P ＜0.01 vs hypoxia+negative control shRNA group.圖3 shRNA轉(zhuǎn)染和缺氧后心肌細胞caspase－3和p－PI3K蛋白表達的變化

心力衰竭和冠心病等心血管疾病發(fā)病過程中伴隨著心肌細胞的凋亡［11－12］。本研究制備了急性缺氧損傷模型模擬臨床心肌缺血損傷誘導(dǎo)心肌細胞的凋亡。而ROCK1和ROCK2表達下調(diào)能抑制缺氧導(dǎo)致的心肌細胞凋亡增強、存活降低的作用，這提示我們也許可以通過下調(diào)ROCK1和ROCK2的表達來治療與心肌細胞凋亡有關(guān)的心血管疾病。Caspase在細胞凋亡過程中起中樞性作用。激活的caspase作用于其底物蛋白，使蛋白分解引起凋亡［13－14］。ROCK1是活化的caspase－3的直接裂解底物，而ROCK1活化的裂解產(chǎn)物增加時，又能導(dǎo)致caspase－3的激活，對凋亡起正反饋作用［15］。本研究中，缺氧損傷可導(dǎo)致心肌細胞 caspase－3表達升高，而ROCK1和ROCK2表達下調(diào)能抑制缺氧導(dǎo)致的caspase－3表達升高作用。這進一步證明，ROCK1和ROCK2表達下調(diào)能抑制缺氧導(dǎo)致的心肌細胞凋亡的作用。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K在缺血預(yù)適應(yīng)和缺血再灌注損傷中被激活，進而抑制心肌細胞凋亡，發(fā)揮心肌保護作用［16－17］。p－PI3K是 PI3K的活化狀態(tài)。本研究中，缺氧損傷可導(dǎo)致心肌細胞p－PI3K表達降低，而ROCK1和ROCK2表達下調(diào)能抑制缺氧導(dǎo)致的p－PI3K表達降低作用。綜上所述，ROCK1和ROCK2表達下調(diào)能抑制缺氧導(dǎo)致的心肌細胞凋亡增強、存活降低的作用，并且其機制與抑制caspase－3活化和增強p－PI3K的表達有關(guān)，這為與心肌細胞凋亡有關(guān)的心血管疾病的治療提供一種可能的途徑。

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