董 梅，袁宏宇，劉瑞春，郭 力，檀國軍，吳紅然

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，神經(jīng)病學(xué)河北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050000)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)炎性脫髓鞘疾病，病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確。其特征性病理特點(diǎn)為不同程度的髓鞘脫失、炎癥細(xì)胞浸潤、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和繼發(fā)的軸索損傷。近年研究認(rèn)為在MS患者及其實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)動物模型發(fā)病早期即有軸索損傷，與炎性破壞有關(guān)［1］，并發(fā)現(xiàn)異常磷酸化tau蛋白與慢性緩解復(fù)發(fā)EAE和繼發(fā)進(jìn)展MS中神經(jīng)元和軸索缺失相關(guān)，導(dǎo)致組織變性，使疾病向慢性階段進(jìn)展［2］。我們擬建立EAE大鼠動物模型，用免疫組化方法測定發(fā)病早期軸索損傷的標(biāo)記物β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，β-APP)及變性標(biāo)志物磷酸化tau蛋白的沉積和動態(tài)變化，應(yīng)用改良Bielschowsky軸索染色動態(tài)評估軸索缺失，探討EAE發(fā)病中炎癥、軸索損傷的動態(tài)變化及其與神經(jīng)功能障礙之間的關(guān)系。

材料和方法

1 動物模型的建立及分組

從河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心選購約6～8周齡Wistar大鼠60只［SCXK(冀)2003212003］，雌性，體重 180-200 g。用新鮮豚鼠的全脊髓制成勻漿加上完全福氏佐劑(complete Freund's adjuvant，CFA)，佐劑中所含卡介苗量為 6 g/L，乳化后按0.5 mL/只分別于大鼠四足墊內(nèi)及背部皮下注射，免疫動物［3］。實(shí)驗(yàn)動物分3組，正常組、急性組和癱瘓組，每組6～8只。

2 神經(jīng)功能評分

所有實(shí)驗(yàn)動物自免疫當(dāng)日起觀察大鼠的精神狀態(tài)、反應(yīng)是否靈敏，進(jìn)食水情況，大小便情況、尾部與肢體力量情況等。參照Kono等提出的標(biāo)準(zhǔn)，將發(fā)病程度分為5級:Ⅰ級動物尾部無力;Ⅱ級尾部無力+肢體無力;Ⅲ級肢體輕度麻痹;Ⅳ級肢體嚴(yán)重麻痹，被動翻身后不能復(fù)原;Ⅴ級瀕死狀態(tài)。選取發(fā)病程度Ⅱ級及其以上，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)取材。

3 標(biāo)本采集

60只大鼠中正常組取8只，將剩余52只大鼠進(jìn)行免疫，制備EAE模型，EAE大鼠在免疫后12 d相繼出現(xiàn)癥狀，依據(jù)臨床表現(xiàn)和發(fā)病過程取急性發(fā)病3 d大鼠作為急性期組，呈緩解-復(fù)發(fā)病程、發(fā)病2～3次并遺留有肢體癱瘓大鼠作為癱瘓組，取脊髓固定于4%多聚甲醛中，制成蠟塊后切片5 μm，觀察組織病理及免疫組化改變。

4 組織病理

取各組組織分別進(jìn)行HE染色，觀察炎癥和軸索損傷的情況。

5 免疫組化染色

將所取組織分別進(jìn)行tau蛋白和β-APP免疫組化染色，觀察兩者在正常組、急性期組和反復(fù)發(fā)病致殘的癱瘓組組織中的分布及表達(dá)情況。兔抗大鼠磷酸化tau(pSer202)購于武漢博士的生物工程有限公司，以1∶200比例稀釋;兔抗大鼠β-APP抗體以1∶100稀釋。Ⅱ抗為生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，Ⅲ抗為辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，按照SP法進(jìn)行免疫組化染色。PBS為空白對照，結(jié)果為陰性。胞漿棕褐色為陽性染色。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，β-APP和tau蛋白陽性細(xì)胞數(shù)的多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。取α=0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié) 果

1 臨床表現(xiàn)及神經(jīng)功能評分

免疫的52只大鼠中共有40只大鼠發(fā)病，發(fā)病率為76.8%。大鼠免疫后出現(xiàn)精神萎靡、食欲減退、皮毛不光滑、體重下降，于免疫后第12 d開始發(fā)病，出現(xiàn)尾部張力減低、尾部無力，繼之迅速出現(xiàn)后肢、四肢無力、麻痹，大小便失禁，少數(shù)表現(xiàn)為僅雙前肢的無力或癱瘓，無因病情危重而死亡。取發(fā)病3 d的急性期組大鼠8只，均在癱瘓高峰期取材，臨床神經(jīng)功能評分為4.13±0.84，剩余32只大鼠中有14只表現(xiàn)為復(fù)發(fā)-緩解型，發(fā)病2～3次，恢復(fù)期完全緩解3只，其余11只遺留有不同程度肢體癱瘓，取6只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，神經(jīng)功能評分為2.50±0.55，均在60 d內(nèi)取材。臨床癥狀評分急性組和癱瘓組與正常組比較差異顯著(P＜0.01)，癱瘓組與急性組比較差異顯著(P＜0.01)，見表1。

表1 各組神經(jīng)功能評分比較Table 1.Comparison of neurological scores in each group()

表1 各組神經(jīng)功能評分比較Table 1.Comparison of neurological scores in each group()

＊＊P ＜0.01 vs normal group;##P ＜0.01 vs acute group.

Normal 8 0 Acute 8 4.13 ±0.84＊＊Paralyzed 6 2.50 ±0.55＊＊##

2 組織病理變化

正常組神經(jīng)組織染色未見異常，急性組大鼠脊髓可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，呈大片狀，尤以白質(zhì)及灰白質(zhì)交界處明顯，灰質(zhì)內(nèi)也有較多炎癥細(xì)胞浸潤，白質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松;癱瘓組大鼠可見多個“血管袖套”結(jié)構(gòu)，小血管周圍有明顯炎癥細(xì)胞浸潤，脊髓灰、白質(zhì)及其交界處多處可見，白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，呈空泡樣改變，見圖1。

3 免疫組化結(jié)果

3.1 β-APP免疫組化結(jié)果 正常組脊髓白質(zhì)內(nèi)可見部分神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少數(shù)散在分布的軸索中β-APP呈陽性表達(dá)，軸索中β-APP陽性細(xì)胞數(shù)目是36.80±3.11;急性組在大片狀炎細(xì)胞分布區(qū)內(nèi)可見部分神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和明顯增多的軸索β-APP呈陽性表達(dá)，軸索中陽性細(xì)胞數(shù)目是141.00±7.87，非炎癥區(qū)域陽性表達(dá)明顯減輕;癱瘓組也可見部分神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及較多軸索β-APP呈陽性表達(dá)，軸索中陽性細(xì)胞數(shù)目是114.20±12.91，組織內(nèi)未見炎癥細(xì)胞浸潤。急性組及癱瘓組β-APP陽性細(xì)胞數(shù)均高于對照組，差異均顯著(P＜0.01);急性組和癱瘓組陽性細(xì)胞數(shù)比較差異顯著(P＜0.01)，見圖 2、表 2。

Figure 1.Histopathological changes of rat spinal cord tissues in different groups(HE staining，×200).A:normal group;B:acute group;C:paralyzed group.圖1 各組大鼠脊髓組織的病理變化

Figure 2.The expression of β -APP in different groups(immunohistochemical staining，× 400).A:normal group;B:acute group;C:paralyzed group.圖2 β－APP在各組大鼠脊髓組織中的表達(dá)

表2 各組β－APP和tau蛋白表達(dá)比較Table 2.The expression of β-APP and Tau proteins in different groups(.n=5)

表2 各組β－APP和tau蛋白表達(dá)比較Table 2.The expression of β-APP and Tau proteins in different groups(.n=5)

＊＊P ＜0.01 vs normal group;##P ＜0.01 vs acute group.

Group β-APP Tau Normal 36.80±3.11 7.00±1.58 Acute 141.00 ±7.87＊＊ 32.40 ±5.41＊＊Paralyzed 114.20 ±12.91＊＊## 80.20 ±5.89＊＊##

3.2 Tau免疫組化結(jié)果 正常組膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)偶有少量tau蛋白表達(dá)，少數(shù)軸索呈陽性表達(dá)，陽性軸索數(shù)為7.00±1.58;急性組在大片狀炎癥細(xì)胞分布區(qū)內(nèi)可見少量軸索內(nèi)有tau蛋白沉積，呈陽性表達(dá)，陽性軸索數(shù)為32.40±5.41;癱瘓組可見軸索內(nèi)大量tau蛋白沉積，陽性軸索數(shù)為80.20±5.89，并連接成片狀，白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，呈空泡樣改變，組織內(nèi)未見炎癥細(xì)胞浸潤，見圖2。急性組及癱瘓組tau陽性細(xì)胞數(shù)均高于對照組，差異均顯著(P＜0.01);急性組和癱瘓組陽性細(xì)胞數(shù)比較差異顯著(P＜0.01)，見圖3、表2。

Figure 3.The expression of tau protein in different groups(immunohistochemical staining，×200).A:normal group;B:acute group;C:paralyzed group.圖3 Tau蛋白在各組大鼠脊髓組織中的表達(dá)

討 論

MS的基本病理改變是炎癥、髓鞘脫失、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和軸索損傷，盡管在100多年前就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)軸索損傷是MS的病理表現(xiàn)，但它只作為疾病后期伴隨髓鞘脫失而發(fā)生的繼發(fā)性改變，直到最近它在疾病發(fā)生和發(fā)展中的作用才受到重視。有研究表明在疾病的初始及整個病程中都伴有軸索損傷，并與疾病的臨床表現(xiàn)密切相關(guān)，EAE是MS公認(rèn)的動物模型，我們通過動態(tài)研究不同發(fā)病時期EAE大鼠軸索損傷，探討軸索損傷在EAE發(fā)病初始及病情進(jìn)展過程中的作用和意義。

β-APP是通過軸突快速轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制運(yùn)輸?shù)囊环N神經(jīng)元正常成分，通常表達(dá)水平低，可在部分神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長分化、增加神經(jīng)突觸的可塑性、參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、促進(jìn)細(xì)胞黏附及神經(jīng)保護(hù)作用。當(dāng)腦或脊髓組織發(fā)生急性病變時，包括炎癥、缺血、外傷等情況，由于β-APP的軸突運(yùn)輸被阻斷而出現(xiàn)β-APP的聚集。我們的研究表明在EAE發(fā)病急性期，大鼠癱瘓最嚴(yán)重時有大量炎癥細(xì)胞浸潤，彌散分布在組織中，炎癥細(xì)胞分布區(qū)內(nèi)可見明顯增多的β-APP陽性表達(dá)，表明炎癥可損傷軸索導(dǎo)致β-APP運(yùn)輸阻斷而發(fā)生聚集;在緩解期癱瘓組大鼠組織內(nèi)也可見部分β-APP表達(dá)，表明在非炎癥期也持續(xù)存在軸索破壞，軸索損傷呈現(xiàn)不依賴炎癥破壞的動態(tài)過程。Shriver等［4］研究表明在疾病早期致敏T細(xì)胞即炎癥攻擊可導(dǎo)致軸索可逆性神經(jīng)功能障礙。在EAE中血管周圍巨噬細(xì)胞表達(dá)iNOS與軸索損傷的短暫神經(jīng)功能障礙有關(guān)，反映了局部可逆的APP的累積［5］。Garay等［6］發(fā)現(xiàn)在 EAE 發(fā)病后軸索密度下降、呈多空樣結(jié)構(gòu)、軸索APP陽性表達(dá)。Herrero-Herranz等［7］研究了軸索損傷的形式，病灶中軸索密度在疾病早期已有明顯降低，并貫穿整個疾病過程。在灰質(zhì)、晚發(fā)病灶周圍及表現(xiàn)正常的腦白質(zhì)均有明顯的軸索缺失。遠(yuǎn)離病灶的進(jìn)展性軸索缺失主要與神經(jīng)絲磷酸化改變、Na通道重新分布和脫髓鞘有關(guān)。這種軸索缺失與急性炎癥浸潤分離，和臨床殘疾明顯相關(guān)，提出治療上在急性期以抗炎、后期以對抗變性機(jī)制為主。我們的結(jié)果也支持軸索損傷與炎癥分離的結(jié)果。

Tau蛋白是神經(jīng)細(xì)胞主要的微管相關(guān)蛋白，可穩(wěn)定神經(jīng)元的細(xì)胞支架，然而，高度磷酸化的tau蛋白則擾亂神經(jīng)元微管、干擾神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運(yùn)，最終導(dǎo)致突觸功能的紊亂，神經(jīng)元功能的削弱與衰退［8］。我們的研究表明正常大鼠脊髓組織內(nèi)幾乎沒有tau蛋白沉積，EAE急性組大鼠可見在大片狀炎細(xì)胞分布區(qū)內(nèi)有少量tau蛋白沉積，表明在急性期炎癥可以促使少數(shù)損傷嚴(yán)重的軸索發(fā)生變性，使代表神經(jīng)變性的異常磷酸化tau蛋白陽性表達(dá);癱瘓組大鼠可見大量異常tau蛋白沉積，白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，但不伴炎癥細(xì)胞浸潤，表明tau蛋白導(dǎo)致的神經(jīng)變性是隨疾病進(jìn)展逐漸出現(xiàn)的，與神經(jīng)功能障礙的發(fā)生是一致的。Schneider等［9］研究發(fā)現(xiàn)在急性EAE腦干中有異常磷酸化的無定形的tau蛋白沉積在脫髓鞘區(qū)的神經(jīng)元胞體和軸索內(nèi)，提示炎癥可以觸發(fā)tau蛋白異常磷酸化，而軸索損傷與異常tau蛋白有關(guān)。Centonze等［10］研究表明炎癥引起可溶性炎性因子和興奮性谷氨酸釋放，改變了興奮性突觸傳遞，在疾病非炎癥階段發(fā)生刺激引發(fā)繼發(fā)性神經(jīng)變性。Soulika等［11］研究提示EAE發(fā)病早期的炎癥浸潤及后期免疫介導(dǎo)的神經(jīng)變性過程均可導(dǎo)致軸索缺失，發(fā)生神經(jīng)功能障礙。EAE小鼠在出現(xiàn)持續(xù)的活動障礙前已有15%～30%脊髓軸索缺失，這種軸索損害可以靜止許多年，只有當(dāng)軸索缺失達(dá)到一定閾值后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)失代償后，發(fā)生不可逆的神經(jīng)功能缺失。我們的結(jié)果支持上述學(xué)者的研究結(jié)果，在疾病早期炎癥導(dǎo)致的軸索損傷為可逆性，癱瘓可以恢復(fù)，后期軸索發(fā)生明顯變性，導(dǎo)致大鼠癱瘓，并呈不可逆神經(jīng)功能障礙。Basso等［12］新近發(fā)現(xiàn)fullerene與NMDA受體拮抗劑的復(fù)合物ABS-75可以對抗氧化、減輕軸索缺失和髓鞘脫失，具有治療進(jìn)展型MS和其它變性疾病的神經(jīng)保護(hù)作用，為MS的治療提供了新的靶點(diǎn)。

總之，我們的研究表明，在EAE發(fā)病過程中軸索損傷呈動態(tài)變化，與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，與臨床神經(jīng)功能障礙有關(guān)，軸索缺失程度即是否發(fā)生明顯軸索變性決定了神經(jīng)功能是否呈永久性損害，在EAE的發(fā)病中有重要的作用機(jī)制。神經(jīng)變性主要存在于慢性EAE病程中，發(fā)生神經(jīng)變性的組織病理學(xué)特性包括軸索結(jié)構(gòu)破壞、神經(jīng)元胞體凋亡［13］。所以軸索損傷可以發(fā)生在疾病初始，與病灶的炎癥、脫髓鞘及臨床表現(xiàn)有關(guān)，也可以呈隱匿損傷，在臨床上數(shù)年無表現(xiàn)，直到損傷達(dá)到一定程度，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)中失代償反應(yīng)，發(fā)展為不可逆的神經(jīng)功能缺損。

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