不同煙草青枯病抗性品種的蛋白質(zhì)組學比較

宋 浩 ，丁 偉 ，沙 偉 ，周 燕 ，陳 薇 *

（1.湖南中煙工業(yè)有限責任公司，長沙 410014；2.上海中科新生命生物科技有限公司，上海 200233；3.中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞研究所蛋白質(zhì)組學中心，上海 200233）

煙草青枯病是由茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種毀滅性災害。其最顯著的癥狀是枯萎，一旦發(fā)病即可造成全株死亡，對煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量影響極大。煙草青枯病廣泛分布于全球各地，以熱帶和亞熱帶地區(qū)的危害最為嚴重。世界各地每年都有青枯病的發(fā)生和流行，造成了巨大的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟損失[1]。因此，研究青枯菌致病機理和尋找有效的防治青枯病的方法是當前植物病理學研究的重要課題之一[2]。目前對于煙草青枯病抗性機理的研究，主要集中在基因定位和分子標記輔助育種[3]、基因組學[4-6]和抗性基因的轉(zhuǎn)化[7-9]等方面，而在蛋白質(zhì)組水平上的研究在國內(nèi)外還未見正式報道。

蛋白質(zhì)組學是“后基因組時代”迅速發(fā)展起來的技術體系，通過高通量和高分辨率的蛋白分離鑒定技術可以全景式地研究一種生物基因組編碼的全部蛋白質(zhì)[10-13]。蛋白質(zhì)組學技術在生長發(fā)育[14]和各種外界因素作用下的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和豐度的變化[15-18]等熱點研究領域已成為一種十分有效且應用廣泛的分析手段，該技術有助于在蛋白水平上全面系統(tǒng)認識病原菌侵染后宿主的抗病特點和包括細胞代謝在內(nèi)的多個生物學過程。本研究以兩個不同青枯病抗性煙草品種的葉片為研究材料，采用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜分析技術，對不同的青枯病抗性品種的蛋白質(zhì)表達譜進行比較研究，旨在探討不同青枯病抗性煙草品種在蛋白質(zhì)組學水平存在的差異及其對青枯病抗性的影響，為進一步明確煙草的抗青枯病機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草（Nicotiana tabacumL.）品種為抗青枯病品種DB101和易感品種紅花大金元。于2010年3月12日進行播種，出苗65 d后取所有葉片，立即在清水中洗凈，吸水紙吸干水分，然后用鋁箔紙包裹，于-80 ℃冰箱備用。

1.2 試劑

載體兩性電解質(zhì)pH 3～10為GE公司產(chǎn)品；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、SDS、TEMED、溴酚藍、Tris-base、甘氨酸等為Bio-Rad公司產(chǎn)品；NP-40、碳酸氫銨、三氟乙酸（TFA）、乙腈（CAN）、α-氰基-4-羥肉桂酸（HCCA）等為Fluka公司產(chǎn)品；尿素（超純）、硫代硫酸鈉（Na2S2O3·5H2O）、過硫酸銨、鐵氰化鉀、碳酸鉀、β-巰基乙醇等為Amresco公司產(chǎn)品；碘乙酰胺、DTT、Triton X-100等為 Sigma公司產(chǎn)品；胰蛋白酶（Trypsin）為Promega公司產(chǎn)品。

1.3 蛋白質(zhì)提取

稱取1.2 g左右葉片，參照Yan等[19]的方法進行葉片全蛋白提取和裂解，按Bradforf法[20]測定裂解后的樣品蛋白質(zhì)濃度，每根膠條的蛋白上樣量約為 100 μg。

1.4 雙向電泳（2-DE）

二維凝膠電泳參照Casado-Vela等[21]及Yan等[19]的方法進行，參照Yan等[19]的方法進行銀染色。

1.5 凝膠圖譜分析及差異點的確定

所有凝膠在染完色以后使用 Umax PowerlookⅢ掃描儀進行掃描，用ImageMaster 5.0軟件對分析性圖譜進行分析。當兩者之間的 Ratio值大于 1.2時，認為具有顯著性差異。確定差異表達的蛋白質(zhì)點，并從制備膠上挖取差異點。

1.6 MALDI-TOF/TOF MS 分析及數(shù)據(jù)庫檢索

將凝膠上的蛋白質(zhì)差異點切下后，參照Fernandez等[22]和Gharahdaghi等[23]的方法進行蛋白質(zhì)膠內(nèi)消化，萃取出肽段。用2 mL 20%乙腈溶解肽段，取1 μL樣品干燥后加人0.5 μL HCCA基質(zhì)飽和溶液，混合均勻，上樣1 μL至點樣靶上。室溫干燥后，使用美國應用生物系統(tǒng)公司（ABI）ABI 4800 Proteomics Analyzer MALDI-TOF/TOF進行分析。質(zhì)譜參數(shù)設置如下：反射模式，正離子檢測，一級質(zhì)譜的質(zhì)量掃描范圍為800～4 000 Da。對于每一個樣品，選擇信噪比最強的8個峰分別作為母離子，然后進行二級質(zhì)譜分析。獲得的一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用GPS Explore V3.6（ABI）軟件進行分析，分析后的每一個樣品的一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，使用 MAsc0T（v2.2）搜庫軟件對本地數(shù)據(jù)庫進行檢索，鑒定蛋白質(zhì)。檢索參數(shù)設置如下：數(shù)據(jù)庫為NCBInr；物種為綠色植物；切割的酶為 Trypsin；允許最大的未被酶切位點數(shù)為 1；可變修飾為甲硫氨酸氧化；固定修飾為脲甲基化，母離子質(zhì)量容差為1×10-4Da；片段離子質(zhì)量容差為0.4 Da。

2 結(jié) 果

2.1 DB101和紅花大金元煙葉全蛋白的雙向電泳圖譜

DB101和紅花大金元葉片中的雙向電泳圖譜見圖1。pH 3～10的范圍內(nèi)，2個樣品經(jīng)銀染后均可得到1 800～2 000個蛋白點，并且可以看出蛋白在等電點和分子量兩個方向都得到了較好的分離。

圖1 煙草葉片總蛋白的雙向電泳圖Fig.1 Representative 2-DE gels of tobacco leaf proteins

2.2 差異表達蛋白點的質(zhì)譜鑒定

定量分析發(fā)現(xiàn)共有 26個蛋白點的表達發(fā)生顯著變化（Ratio≥1.2），相對于易感品種紅花大金元，在抗病品種DB101中有12個上調(diào)蛋白和14個下調(diào)蛋白（圖1）。對這26個差異蛋白點用串聯(lián)質(zhì)譜的方法（MS/MS）成功鑒定出 22個（二級質(zhì)譜匹配肽段得分Score超過60并且匹配可信度大于95%）（表1）。根據(jù)這22個蛋白所參與的代謝途徑和生化功能將它們歸納成以下6個類群：表達調(diào)控、過氧化物平衡、光和作用、代謝和能量、防衛(wèi)相關蛋白和推測蛋白。其中表達調(diào)控類有5個蛋白：次黃嘌呤核苷酸環(huán)水解酶、核苷二磷酸激酶2、30 S核糖體蛋白、TCP-1型分子伴侶和酪蛋白裂解酶。過氧化物平衡類有3個蛋白：胞質(zhì)抗壞血酸過氧化物酶、類囊體膜抗壞血酸過氧化物酶和基質(zhì)體膜抗壞血酸過氧化物酶。光合作用類有7個蛋白：谷氨酸-1-半醛2、1-氨基變位酶、光合系統(tǒng) I反應中心亞基 II、羥基丙酮酸還原酶、磷酸酐酶、核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶/加氧酶和2個ATP酶。代謝和能量類有2個蛋白：異檸檬酸脫氫酶和谷氨酸脫氫酶B。防衛(wèi)相關蛋白有二氨基庚二酸脫羧酶、24Kgermi-like蛋白、乙二醛酶和煙草凝集素。同時還有一個未知蛋白。

表1 差異表達蛋白的MS/MS鑒定結(jié)果Table 1 Different regulated expression proteins in DB101 identified by MS/MS

3 討 論

3.1 表達調(diào)控

植物對病原信號的識別是抗性應答的原初反應，一旦抗病信號轉(zhuǎn)導啟動以后，就可以通過信號轉(zhuǎn)導途徑，可進一步調(diào)節(jié)基因的表達水平，包括轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平及翻譯后水平的調(diào)節(jié)。在轉(zhuǎn)錄水平上，核酸的加工是一個重要的調(diào)節(jié)機制。本鑒定結(jié)果中得到了一個促進次黃嘌呤核苷酸（IMP）生物合成的關鍵酶次黃嘌呤核苷酸環(huán)水解酶（PurH，點443），其在DB101中上調(diào)了1.77倍。IMP做為核苷酸從頭合成途徑中的重要中間載體[24-25]，說明了轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控過程可能在煙草抗青枯病中得到加強。本研究發(fā)現(xiàn)一個在DB101中下調(diào)表達的與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關的蛋白核苷二磷酸激酶 2（NDPK2）。該酶除了催化腺苷三磷酸（ATP）和核苷二磷酸（NDP）之間高能磷酸基團的轉(zhuǎn)移外，還具有 NDP激酶活性和蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，并參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導[26]。翻譯活性的變化被認為是最早脅迫反應之一[27]，30 S核糖體蛋白（30 SRP，點1 977）參與到蛋白的翻譯和合成，其在抗病品種DB101中表達被抑制。翻譯后修飾主要是指蛋白質(zhì)折疊、加工和降解，完成這一調(diào)節(jié)功能的主要是分子伴侶類蛋白。TCP-1型分子伴侶（點392）也叫 CCT復合體，主要來自于真核生物的細胞溶質(zhì)。有研究表明TCP-1型分子伴侶具有重要的亞細胞功能，據(jù)估計細胞內(nèi) 10%蛋白質(zhì)的折疊與其有關[28]。酪蛋白裂解酶（點173，CIP）廣泛存在于生物系統(tǒng)中，其主要功能是促使ATP酶水解ATP提供能量來協(xié)助細胞維持胞內(nèi)蛋白的質(zhì)量，其在分子伴侶、能量依賴性蛋白酶、DNA復制、蛋白質(zhì)折疊、抗逆性和適應性以及基因表達調(diào)控等多個方面起作用[29]。TCP-1型分子伴侶和CIP在DB101中的上調(diào)表達說明翻譯后修飾得到加強。

3.2 過氧化物平衡

越來越多的證據(jù)表明氧化還原的平衡是連接外界環(huán)境脅迫感受和生理調(diào)節(jié)的一個橋梁[30]。在各種脅迫條件下，很容易產(chǎn)生活性氧（Reactive oxygen species，ROS），一方面它可以作為信號分析誘導植物的抗性反應，但另一方面它能夠破化植物的細胞成分。植物在長期的進化過程中形成了一套精細的調(diào)控機制來控制活性氧的量。在本鑒定結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了 3個可以調(diào)控 ROS的抗壞血酸過氧化物酶（APX）：胞質(zhì)抗壞血酸過氧化物酶（點1 528）、類囊體膜抗壞血酸過氧化物酶（點 1 340）和基質(zhì)體膜抗壞血酸過氧化物酶（點1 326）。APX是植物和藻類特有的清除過氧化氫（H2O2）的重要酶類[31]?？箟难徇^氧化物酶主要存在2種同工酶：一種是光合器官型，包括位于基質(zhì)中的APX ( sAPX)和同類囊體膜結(jié)合的 APX（tAPX）；另一種是非光合器官型，主要分布于植物細胞的胞漿、線粒體和乙醛酸循環(huán)體中[32]。本研究中發(fā)現(xiàn)2個光合器官型APX在DB101中均上調(diào)表達，另外1個非光合器官型APX下調(diào)表達，表明抗病品種DB101可能存在一個獨特的通過加強光合器官型抗壞血酸過氧化物酶的活性來控制和協(xié)調(diào)煙草體內(nèi)活性氧平衡的機制。但是這些只是根據(jù)結(jié)果的一個假設，還需要更多的實驗加以驗證。

3.3 光合作用

本研究共發(fā)現(xiàn)了7個與光合作用相關的蛋白：谷氨酸-1-半醛2,1-氨基變位酶（GAS）、光合系統(tǒng)I反應中心亞基 II（PSI-D）、羥基丙酮酸還原酶（GRHPR）、磷酸酐酶（CA）、核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）和2個ATP酶（點302和1 812）。

GAS在植物的葉綠素等色素物質(zhì)的合成過程中起著關鍵性作用[33]，葉綠素的主要功能是不斷提供其所吸收的光能來維持植物光和作用的持續(xù)運轉(zhuǎn)[34]。PSI-D的主要功能是在光合系統(tǒng)I（PSI）中起到電子傳遞鏈的作用，將葉綠體等色素吸收到的光能轉(zhuǎn)化為化學能[35]。本試驗中 GAS和 PSI-D在抗病品種DB101中分別上調(diào)了4.05倍和2.36倍，表明DB101有可能通過提高GAS和PSI-D的活性來加強對光能的吸收來滿足抵御青枯菌侵染的能量需求。由于光合機構(gòu)中的各個組分是緊密聯(lián)系在一起的，任一組分的破壞都將影響整個光合作用的效率，另外兩個與光合能量代謝相關的酶液泡H+-ATP酶A1亞基亞型和ATP合成酶D鏈，它們在 DB101中的下調(diào)表達說明光合磷酸化產(chǎn)生 ATP過程在抗病過程中可能受到抑制。在本鑒定結(jié)果中有2個與卡爾文循環(huán)相關的蛋白（RuBisCO和CA）在DB101中均下調(diào)表達。RuBisCO在光合作用卡爾文循環(huán)里催化第一個主要的碳固定反應，將大氣中游離的二氧化碳轉(zhuǎn)化為生物體內(nèi)儲能分子[36]。CA 是另外一個重要的光合作用酶，它通過催化CO2和HCO-3之間的相互轉(zhuǎn)化反應來降低CO2在葉肉細胞中的擴散阻力，為羧化反應提供底物[37]，同時CA能增加RuBisCO的活性[39]。RuBisCO和CA的下調(diào)表達表明在 DB101中卡爾文循環(huán)可能受到抑制。在卡爾文循環(huán)受到抑制的情況下，本鑒定結(jié)果中得到了一個與光呼吸緊密相關的蛋白 GRHPR在DB101中上調(diào)表達。GRHPR作為光呼吸途徑（相關酶）中活性最大的酶[40]，其上調(diào)表達將會極大地促進光呼吸。目前光呼吸被普遍認為有利于植物在脅迫條件下維持電子傳遞，能夠有效的阻止光抑制的產(chǎn)生[41]。這些都有可能是 DB101具有抗性的原因。

3.4 代謝和能量

在病菌脅迫條件下，植物細胞內(nèi)原有的體內(nèi)平衡被打破。為了建立新的平衡，植物需要啟動各種防御措施，如清除氧自由基、加強離子轉(zhuǎn)運等，這些過程均需消耗能量，所以植物會改變體內(nèi)的初級代謝如碳的能量代謝，使其達到一個新的平衡狀態(tài)[42]。我們發(fā)現(xiàn)在青枯菌侵染之后 DB101中上調(diào)了兩個與糖酵解途徑相關的蛋白：異檸檬酸脫氫酶（IDHs）和谷氨酸脫氫酶 B（GDH）。IDHs可以催化異檸檬酸氧化脫羧形成 α-酮戊二酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）。α-酮戊二酸一方面可進入三羧酸循環(huán)途徑進行有氧呼吸為植物細胞提供能量；同時可為植物細胞對氨的吸收同化提供碳骨架。NADPH則可以維系細胞內(nèi)的氧化還原平衡，幫助植物抵御氧化脅迫[43]。GDH普遍存在于植物中，有研究表明，GDH在植物的衰老過程及逆境如高溫和水分脅迫等狀況下行使其銨同化功能，在黑暗或者碳脅迫條件下又能氧化脫銨從而為三羧酸循環(huán)提供碳骨架[44]。這兩個酶在 DB101中的上調(diào)表達可能會促進糖酵解過程，為各種抗病反應提供更多的能量。

3.5 防衛(wèi)相關蛋白

本研究共鑒定出4個防衛(wèi)相關的蛋白，1個在DB101中上調(diào)的蛋白二氨基庚二酸脫羧酶（DAPDC），3個下調(diào)的蛋白24Kgermi-like蛋白、乙二醛酶（GLO）和煙草凝集素（Nictaba）。DAPDC作為 L-賴氨酸合成的關鍵酶在細菌的相關研究中被大量報道，但在植物中僅有玉米、小麥和煙草等幾個物種被提及[45]，本鑒定得到的DAPDC為植物的 L-賴氨酸合成研究提供了一部分數(shù)據(jù)。同時DAPDC作用的產(chǎn)物L-賴氨酸在植物蛋白質(zhì)合成代謝中必不可少，而且賴氨酸合成前體 DAP的跨壁結(jié)構(gòu)可以穩(wěn)定細胞壁的結(jié)構(gòu)并抵抗細胞內(nèi)的滲透壓力[46]。本試驗表明，增強表達的DAPDC可能在煙草對青枯菌侵染的防衛(wèi)響應中扮演著特殊角色。24Kgermi-like蛋白是在多種植物中存在的與Germin具有同源性的一類蛋白。Germin是一種同源五聚體糖蛋白，其可能通過控制細胞壁的伸展性而參與植物的早期發(fā)育，同時它們的表達還受病原菌、非生物脅迫及光周期等因素的調(diào)控[47]。GLO廣泛存在于原核和真核生物中，參與到細胞內(nèi)分解毒素甲基乙止醛的代謝過程中。因此 GLO催化的化學反應可能參與細胞內(nèi)的一種解毒機制，同時發(fā)現(xiàn)過表達GLO可以提高煙草的抗鹽性[48]。Nictaba屬于植物凝集素的一種。Nictaba主要分布于煙草葉片薄壁組織細胞中，不僅對病原真菌、細菌和昆蟲有一定的抑制作用，在逆境脅迫下還可以通過控制細胞信號轉(zhuǎn)導參與到基因表達調(diào)控中[49]。24Kgermi-like蛋白、GLO和Nictaba是3個研究比較透徹的病原防衛(wèi)相關蛋白，但在本研究中抗病品種 DB101并沒有呈現(xiàn)出從無到有或從低到高的誘導表達，而在易感品種紅花大金元中的上調(diào)表達說明它們可能會增強感病煙草對青枯病的易感性。

4 結(jié) 論

本研究表明，抗病煙草品種DB101對煙草青枯病病原菌的侵染存在一個復雜的抗病信號轉(zhuǎn)達和生理調(diào)控網(wǎng)絡，其作用機制可通過差異表達的蛋白質(zhì)反饋出來。在抗性品種DB101中上調(diào)表達的蛋白質(zhì)，尤其是脅迫相關的蛋白質(zhì)，如次黃嘌呤核苷酸環(huán)水解酶、二氨基庚二酸脫羧酶、光和器官型抗壞血酸過氧化物酶、異檸檬酸脫氫酶和谷氨酸脫氫酶B等，推測可能與煙草青枯病抗性有關，其中逆境脅迫蛋白及抗氧化脅迫蛋白質(zhì)可能是煙草抗青枯病病菌侵染的重要因子，在煙草耐受逆境脅迫反應與抗病反應的“交叉對話”中發(fā)揮重要作用。而在易感品種紅花大金元中，磷酸酐酶、核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶/加氧酶以及 ATP酶等的上調(diào)表達則表明光合作用卡爾循環(huán)以及電子傳遞鏈在青枯菌侵染下的紊亂和降解；24Kgermi-like蛋白等則有可能會增強感病煙草對青枯病的易感性。此外，本研究中尚有 4個未能鑒定到的差異蛋白和一個未知蛋白，可能與煙草對青枯病的抗病性存在一定的相關性。總之，煙草對青枯病抗性機制復雜，其中涉及到眾多的信號物質(zhì)和抗性相關蛋白，隨著蛋白質(zhì)組學等技術的發(fā)展和應用，將會有更多的抗性相關基因和蛋白被挖掘，進而大大提高人們對煙草與青枯菌互作機理的認識。

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